检测癌基因及其产物的标本可以是实体瘤和体液，前者需要提取DNA或RNA进行检 测，或经过组织切片以免疫组化方法检测基因表达产物，或者采用血尿标本，用 ELISA等法检测癌基因蛋白，几种主要检测方法介绍如下.

(一)Southern杂交法

　　该法系提取实体瘤标本中的DNA，经过酶切，电泳再转印到硝酸纤维膜上，以特 定的癌基因探针进行检测，该法十分特异，但比较复杂，而且采用³²P标记，在临床 实验室不易推广.采用自动化程序分析Southern印迹，并用非放射性物质标记，有可 能使这种方法在癌基因诊断中常规化.

(二)原位杂交

　　将组织，细胞固定在玻片或硝纤膜上，经适当处理后，与相应探针杂交，可确定 与探针互补序列在细胞内的定位或确定含特异癌基因的组织培养细胞，或者细胞在组 织培养碟内生长至70%融合时，将硝纤膜放在细胞单层上，轻轻加压，使滤膜表面与 细胞层完全接触，细胞被转印至硝纤膜上，室温干燥后，烘干，预杂交，再与³²P-dCT P标记探针杂交，最后用X光自显影或β显微镜检测，可以在待检细胞中显示癌基因的 存在.

(三)酶联免疫吸附试验

　　检测癌基因蛋白可采用酶联免疫吸附(ELISA)法，如在检测myc蛋白时，先用总 myc抗体包被，细胞裂解物中捕捉c-myc，N-myc和L-myc蛋白，最后加入结合碱性磷化 酶的抗-myc抗体，以AMPAK系统显示结果，即碱性磷酸酶通过脱磷酸作用使NADP变成 NAD，再通过氧化还原反应使无色体DNA-Violet还原为有色的甲潜，比色测定结果， 此法检测P62c-myc的灵敏度可达3pg，EDSA法显效，特异，简便，只有有相应基因蛋 白的抗体，就可以检测，因而在癌基因蛋白检测中广为应用.

(四)免疫组化染色

　　这种方法是检测癌基因蛋白较常用的方法.如检测c-erbB-2基因，常规制备组织 切片，加入稀释的抗体，再加上亲和素生物素-过氧化物酶复合物，底物显色，抗 c-erbB-2，证明C-erbB-2蛋白定位在细胞膜上，免疫组化技术是目前对癌基因蛋白进 行细胞定位的优选方法.

(五)PCR技术

　　PCR技术是一门新型快速诊断技术，它利用热稳定的DNA合成酶-Taq多聚酶，在体 外合成特异的DNA片段，两条寡核苷酸引物结合在待扩增DNA的两侧，通过反复循环的 DNA变性，引物退火和延伸，短时间内可使目的DNA得到大量扩增，这种方法可以检测 癌基因的最有效方法，尤其是癌基因在结构上微小改变如重排，缺失，扩增，突变等 都能快速诊断，癌基因表达水平的高低同样能用定量PCR快速诊断，尤其运用PCR定点 突变技术可以改变物种的遗传性状，在肿瘤的基因治疗方面获的广泛应用，总之，随 着分子生物学的发展，PCR及其相关技术已经渗透到各个研究领域，并成为遗传学， 生物学，肿瘤学等研究的崭新手段，更为可喜的是，PCR技术不仅仅在基础研究中获 得广泛应用，而且在临床诊断和疗效评估方面获得越来越广泛的应用，给医学带来了 一场深远革命.

(六)PCR相关技术

　　PCR飞速发展和广泛应用于科学研究和临床医学实践中，在不同领域里发挥了巨 大的作用，促进了生物学研究很多不同领域的发展，但由于检测目的的不同，实际应 用中的方法也有差异.基于对PCR基本原理的认识和基本技术的掌握，相应地派生出了 许多的新的相关技术和改良方法，如:PCR-RFLP法，PCR-DNA测序法，以及可用于原位 检测微量DNA的原位PCR法，这些方法极在地便利了鉴定和分析真核DNA的突变和检测 所欲测目的基因的变化，从而成为PCR技术的有益和实用性的延伸和补充.

　　1.PCR-RFLP技术:PCR-RFLP全称多聚酶链反应(PCR)一限制性片段长度多态性 (restriction fragment length Polymorphism，RFLP)分析.PCR-RFLP主要有三个环 节:(1)靶基因PCR扩增;(2)扩增的DNA片段限制性酶切图谱(长度多态性).该术应用PCR 将目的基因片段扩增百万倍以上，即使被测样品核酸量小于pg水平，也能被扩增出 来，这不仅大大提高了基因分析的灵敏度，而且无需标记或放射性探针杂交过程.PCR -RFLP主要用于核酸变异性分析与比较，当DNA或RNA分子由于单碱基突变或序列重 排，使某种酶切位点增加，减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，就产生 了限制性片段长度多态性，由于限制性内切酶在DNA分子上有特异的酶切位点，根据 其识别序列的位置和数量，可以把大小相似而序列有差异DNA切割成不同的片段通过 核酸电泳，可将长度不等的DNA片分离而显出其长度多态性(片段的大小).

　　PCR-RFLP用于基因分析具有分辩率高，重复性好，简便快速直观等优点，主要用 于微生物的分群分型分亚型，癌基因分析，遗传病的诊断，HLA分型及载脂蛋白基因 的分析等.

　　2、PCR-SSCP技术:PCR-SSCP是聚合酶链反应一单链构象多态性分(single strand conformation polymorphism)的简称，原理是将经扩增的DNA片段经过变性处 理，形成单链，由于序列不同，单链构象就有差异在中性聚丙烯酰胺凝胶中电泳的迁 移率不同，通过与标准物的对比，即可检测出有无突变.SSCP技术自创立以来，经历 了自身的发展完善过程，刚建立时是将同位素掺入PCR扩增的产物中，通过放射自置 影来显示结果这给技术推广造成一定困难，随后有人把DNA的银染方法与PCR-SSCP结 合起来，用银染取代同位素显示DNA带型，大大降低了成本，具有经济、快速、灵敏 等特点.1993年起用EB染色法显示DNA带型，使得SSCP操作更简单，更经济，更迅速， 目前这种方法己大量应用.

　　PCR-SSCP分析法是一种检测基因变异的方法，具有操作简便、快速、不需特殊设 备，适用于大样本筛选的特征.经己广泛应用于检测各种病原体基因的点突变及缺失 突变，基因的多态性分析等.

　　3.PCR-southern blot: 或Dot blot技术是将PCR扩增产物转移到硝酸纤维膜或尼 龙膜上，再与标记的特异性探针进行杂交，然后放射自显影，来检测有无特定的扩增 片段及相对含量，此种方法，可以直接检测基因的点突变，缺失及重排，比PCR产物 EB染色电泳分离法的灵敏度至少要高103以上，由于非放射性同位素标记的探针的应 用，使得PCR-southern blot应用更简便，现己广泛应用于癌基因:遗传特异基因，病 原体特异基因等方面的研究及检测.PCR-Dot blot即将PCR扩增产物变性后直接点在膜 上，与标记的特异性探针进行杂交，它来时短，可用半定量分析，一张膜上可同时检 测多个样品，缺点是只能看到一个斑点，必须小心控制反应条件，设立阳性及阴性对 照，以便对待检测标本做出正确鉴定.

　　4.不对称PCR直接测序法:扩增产物的测序，可以很容易确定群体中某一特定基因 的序列变异情况，这种方法是了解目的基因突变的最理想方法，在扩增反应中加入不 等量的两段寡核苷酸引物，通过PCR扩增获得单链DNA，然后利用双脱氧法直接测序， 便可知道有无突变.

　　5.原位PCR技术:原位PCR，即聚合酶原位扩增技术，是将PCR技术与原位杂交技术 结合起来，不改变与周围组织的原有位置关系，直接在组织、细胞或病原体原位研究 基因变化的技术.这种技术既提高了杂交的灵敏度，又能直接置微观察病变部位，而 且标本不需特殊处理或制备，不需标记探针，比较省时和经济，尤其对形态学研究具 有其它方法难以比拟的独倒长处，原位PCR自创立以来，已经在神经性疾病，肿瘤中 微生物病原体等多种检测中得到广泛应用.