WESTERN  BLOT  PROTOCOLS

蛋白提取与溶液配制

溶液配制：

RIPA  Lysis Buffer  (1L)

Triton-X100        10ml

SDS               1g

NaCI              8.77g

Tris HCI           2.42g

Deoxycholatic Acid   5g

四种抑制剂：

1、Aprotinin（抑肽酶）

2、PMSF

3、Pepstation

4、Leupeptin（亮抑蛋白酶肽）

提取方法：

1、配制裂解液：10ml RIPA 加入四种抑制剂（按要求稀释）

2、加裂解液60µl，低温刮净细胞，抽打数次。

3、4℃离心，14000g,20min

样本收集后-20℃保存

蛋白浓度测定BSA标准曲线绘制：

1、配制不同浓度的蛋白液浓度分别为：1000µg/ml、750µg/ml、500µg/ml、250µg/ml、50µg/ml五个点。具体方法：

A、1000µg/ml   母液配好4℃存放，用时稀释相应浓度

B、750µg/ml    取75µl母液加双蒸水至100µl

C、500µg/ml    取50µl母液加双蒸水至100µl

D、250µg/ml    取25µl母液加双蒸水至100µl

E、50µg/ml     取5µl 母液加双蒸水至100µl

2、取12 x 75试管，加双蒸水18µl做为空白对照，加2µl Triton-100（1%）共20µl

3、取标准品18微升，加2µl Triton-100（1%）共20µl

4、取样品5µl,加2µl Tritonx-100（1%），加水补足到20µl

4、向各管中加1ml考马斯兰，混匀，2-5min，测定波长595nm的光吸收值A₅₉₅

5、用标准蛋白量浓度为横坐标，A₅₉₅值为纵坐标，作图

6、测样品（3.6倍）

注：测蛋白标准品时由低浓度开始向高浓度测量

Westen Blot

溶液配制：

1、5×电泳缓冲液 （1L）

   Tris碱     15.1 g

   Gly         94g

   10% SDS     50ml

   加蒸馏水定容1L（pH 7.2）

   工作浓度1× ，即取200ml ，定容1L 即可

2、10×TBS （Tris Buffer Salt，pH 7.6,1L）

   Tris 24.2 g

   NaCl 80g

   加水800ml ,调pH 7.6 定容1L

3、TBST （Tris Buffer Salt Tween20 ，1L）

   10×TBS  100ml

   Tween    1ml

   蒸馏水定容1L

4、10×转膜液（1L）

   Tris碱           30.3g

   Gly (甘氨酸)       150.1g

   加水定容至1L

   用时取100 mL ,加甲醇200 mL ,在定容1L 即为1 ×

5、4×Loading buffer

   0.5M Tris-HCl (pH 6.8)         2.5ml

   10% SDS                        4.0ml

   甘油                           2.6ml

   0.5%溴酚兰                     0.4ml

   共9.5ml

   用时取950µl，中加入50µlβ-巯基乙醇 。

6、丽春红染色液

   取丽春红0.5g，用去离子水溶解后，加冰乙酸1ml，去离子水定容至100ml。

7、抗体稀释液

   10%BSA贮存液配制：取BSA 1g ,溶于TBST 10ml 内。临用时取1ml原液，加9ml TBST。

8、硝酸纤维素膜洗脱液

   100mM 2-巯基乙醇、2% SDS、62.5mM Tris-Cl(pH 6.7) 混合

方法：

1、制胶

将两玻璃板底面在桌面对齐，后夹好，检查玻璃板间是否漏水，用滤纸擦干玻璃板

开始制下层胶

   dd H₂O            1.7 ml

   30% 丙烯酰胺      2.0 ml

   Gel Buffer        1.25 ml ( 1.5M Tris-HCl,pH 8.8)

   10% SDS           0.05 ml

   10% APS           25µl  (引发剂)

   TEMED             2.5µl  （催化剂）

   摇匀，立即用1ml 枪头加入玻璃间，后加150µl正丁醇消泡(，待胶和正丁醇间析出水后（凝胶标志，15-30min）,用水冲净正丁醇。

注：正丁醇要均匀加入各个部位，防治由于正丁醇不匀，导致下层胶不平

下层胶高度应距梳子下端大约1cm （由于胶回缩，所以实际应小于1cm）

   制备上层胶

   dd H₂O            1.7 ml

   30% 丙烯酰胺      2.0 ml

   Gel Buffer        1.25 ml ( 0.5M Tris-HCl,pH 6.8)

   10% SDS           0.05 ml

   10% APS           25µl

   TEMED             2.5µl

现在每侧加1ml，然后插梳子，再将剩余的胶加入，胶的上缘约与梳子平齐，5-10min水平向上缓慢拔梳子，注意防止损坏泳道。拔下梳子后，用电泳液冲洗泳道。

2、上样

2.1将蛋白样品加好Lading Dye后，将蛋白变性，即：将蛋白样品在95℃ 5min(注意待温度达到95℃时，才将样品加热，禁止缓慢加热) ，后立即冰上4-5min ， 准备上样。

2.2插好玻璃板，注意短玻璃向内，放置在电泳槽内。

2.3先加好电泳液1×Running Buffer ，水位到两个玻璃之间。

2.4将样品（根据先前计算大约需要40µg样品蛋白需加量，及Lading Dye共10µl）和蛋白分子量marker 4µl加入孔道。

3、电泳

打开电源，电压100v ,样品出孔后，呈水平线是加大电压130-150v ，待跑至两个螺丝底部之间连线停止电泳。总计约1h。

4、电转膜

4.1电泳结束后，取出胶，根据需要样品分子量，休整胶的大小（一般上面去掉上层胶，下面在染料的上缘切割并修整胶大小，形状，并量出大小，根据大小准备滤纸和NC膜。