MALDI-TOF MS是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。《MALDI-TOFMS引领分子诊断新时代》将分为液体芯片飞行时间质谱系统、蛋白指纹微生物鉴定系统、质谱分子成像系统和质谱基因分型系统共4个专题以连载的形式真诚奉献给各位读者，敬请关注！

文/马庆伟  程肖蕊  博扬生命科技有限公司

MALDI-TOF MS简介
MALDI-TOF MS是Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry的英文缩写，即基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱，它是近年来发展起来的一种软电离新型有机质谱，通过引入基质分子，使待测分子不产生碎片，解决了非挥发性和热不稳定性生物大分子解吸离子化的问题，是分析难挥发的有机物质的重要手段之一。
2002年，诺贝尔化学奖授予了美国科学家约翰•芬恩、日本科学家田中耕一和瑞士科学家库尔特•维特里希，以表彰他们发明了对生物大分子进行识别和结构分析的方法。瑞典皇家科学院发表的新闻公报说，芬恩和田中的贡献在于开发出了对生物大分子进行质谱分析的“软解吸附作用电离法”，维特里希的贡献是开发出了用来确定溶液中生物大分子三维结构的核磁共振技术。他们三人的这些研究成果对于研究包括蛋白质在内的大分子具有“革命性的”意义，使人类可以通过对蛋白质进行详细的分析而加深对生命进程的了解，使新药的开发发生了革命性的变化，并在食品控制、癌症的早期诊断等领域也得到了广泛的应用。从此，MALDI-TOF MS在世界范围内得到了突飞猛进的发展，并广泛应用于生物技术和制药企业的药物开发、科研领域的生物分析和化学检测以及安全部门的核辐射、化学物质和生物病原体的监测等。
MALDI-TOF MS的原理是：当用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量，样品解吸附，基质-样品之间发生电荷转移使得样品分子电离，电离的样品在电场作用下加速飞过飞行管道，根据到达检测器的飞行时间不同而被检测，即测定离子的质量电荷之比（M/Z）与离子的飞行时间成正比来检测离子。 MALDI-TOF-MS的中心技术就是依据样品的质荷比（m/z）的不同来进行检测，并测得样品分子的分子量。
根据MALDI-TOF MS的原理，MALDI-TOF MS具有灵敏度高、准确度高、分辨率高、图谱简明、质量范围广及速度快等特点，在操作上制样简便、可微量化、大规模、并行化和高度自动化处理待检生物样品，而且在测定生物大分子和合成高聚物应用方面有特殊的优越性。近年来已成为检测和鉴定多肽、蛋白质、多糖、核苷酸、糖蛋白、高聚物以及多种合成聚合物的强有力工具。如应用MALDI-TOF MS测定蛋白质酶解的肽质量指纹图谱（PMF）、源后裂解（PSD）碎片离子图谱、并结合质谱网络数据库检索，可获得多肽、蛋白质的序列。应用MALDI -TOF MS对基因组单核苷酸多态性（SNPs）进行分析检测，可区分和鉴别相对分子质量达 7,000 左右（含20多个碱基）、仅存在1个碱基差别的不同 DNA 。特别值得指出的是，MALDI-TOF MS已成为生命科学领域蛋白质组研究中必不可缺的重要关键技术之一。

分子诊断现状
据统计，在发达国家，心血管疾病、癌症、中风和神经退行性疾病是四大杀手疾病，其发病率和死亡率都位居榜首。而在我国，肿瘤、心脑血管疾病、糖尿病、感染性疾病、老年性疾病、肝脏疾病、自身免疫性疾病则严重影响着国民身体素质，同样其发病率和死亡率都位居重大疾病榜首。尤其是肿瘤，根据1973~1975年全国人口死因回顾调查及1991~1992年1/10抽样人口死因回顾调查资料，20世纪90年代初，我国每年死于癌症的病例数约130万，估计发病数约160万，死因构成为17.94%，仅次于呼吸系统疾病，居第二位；在随后的 10年，我国肿瘤死亡率继续上升，并成为疾病防治中的主要问题。在2000年，肿瘤位次为肺癌、肝癌、胃癌、食管癌及结直肠癌。死亡率下降最明显的为宫颈癌，上升最明显的为肺癌；另外，结直肠癌及乳腺癌的上升趋势亦不容忽视。这些疾病的共同特点就是其发病机制复杂多样、病因繁多，临床确诊通常已到晚期，而且又没有特效药用于治疗，因此攻克这些疾病就成为本世纪科学家和临床医生所面临的重大医学问题。
医生对于上述重大疾病的有效处置和治疗直接依赖于他们对这些疾病早期状态的诊断能力。比如对于癌症来说，癌症的早期发现对于其最后的控制和预防是至关重要的。尽管先进的诊断方法（如：早期胸部肿瘤X射线透视法、前列腺特异性抗原试验）对于疾病诊断能力有了一定的提高，但还达不到所需的早期疾病发现的灵敏度和特异度。在许多情况下，癌症只有在肿瘤细胞转移到周围组织或者全身恶化情况下才能被诊断。大于60%的患有乳腺癌、肺癌、结肠癌和卵巢癌的病人当存在隐蔽或明显的恶性转移的时候，传统的治疗方法就已无能为力了，所以早期诊断，甚至在原位癌阶段诊断对于提高癌症治愈率极具重要意义。
2001年生理学、医学诺贝尔奖获得者Lee Hartwell博士在2004年亚太地区国际肿瘤生物学暨第21届国际肿瘤标志学术会议上，就如何治疗癌症指出：早期分子诊断可以治疗癌症，早期检测癌症就意味着我们治愈癌症，这是证据确凿的事实。而早期诊断癌症的最新、最有效的方法是通过验血寻找肿瘤标志物，特别是其中的蛋白标志物。事实上，不仅仅是肿瘤，像心肌梗塞、帕金森综合症、白血病等等重大恶性疾病都存在着通过蛋白标志物进行早期分子诊断的可能性。随着分子诊断技术的发展和人民生活水平的提高，人们从得病再上医院（而像肿瘤这样的重大疾病，中晚期发现治愈率极低）逐渐转向更关注健康预警，增加预防措施避免重大疾病的发生与发展。
要达到对这些疾病的早期诊断以及对整个病程及其治疗效果进行有效监控，那么通常需要对体液中单个、特异性已知的标志物进行检测，而目前，人类发现的肿瘤标志物已有百余种，但临床所用常规肿瘤标志物（如：AFP、CEA、CA199、CA125、PSA等）仅有20多种，能用于大规模人群普查的肿瘤标志物则更少。这就需要许多新的标志物的发现和应用。
蛋白质组具有动态性、时间性、空间性和特异性，所以蛋白质基础的分析在疾病检测中极为重要，在血液、尿液、脑脊髓液等体液中可捕捉到这些物质。血清等体液中蛋白质组的疾病相关改变，可能是蛋白质异常表达或者（和）异常脱落进入血清，并随着疾病的发展，这些蛋白在蛋白质组中被修饰或移除；疾病相关蛋白之间的相互作用和蛋白修饰及含量改变着血浆蛋白质组。当体液流经肿瘤微环境时，血清蛋白质组中可能产生许多轻微的未知组份的变化，因此，使用复合的标志物可以较单个标志物更为有效。基于MALDI-TOF MS 的蛋白质组学所产生的“血清质谱多肽谱”则为这一重大问题的解决提供了一把金钥匙。

MALDI-TOF MS引领分子诊断新时代
“血清质谱多肽谱”是指通过生物质谱快速分析血清中“多肽组”精确质量数所得到的谱图，又被誉为“全新健康指纹谱库”技术。谱图中以精确质量数标识的“多肽组”可进一步通过串联质谱分析获得多肽序列，从而鉴定前体蛋白质及其生物来源。MALDI-TOF-MS特别适用于复杂体系中的多肽、蛋白质混合物的分析与鉴定。已经有多项资料标明，血清质谱多肽谱已在恶性肿瘤早期诊断中显示了良好前景。
MALDI-TOF MS（Bruker Daltonics）可检测多种标本，如血清、血浆、尿液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液、组织提取物和各种分泌物，等等。其磁珠系统根据磁珠表面的不同化学成分，可将其分为疏水、亲水、阳离子、阴离子、弱阳离子、弱阴离子、金属离子鳌合（如Cu、Fe）、带有ConA和蛋白G的磁珠。这些磁珠可用于生物样品的制备。
MALDI-TOF质谱仪，作为临床分子诊断工具在生物标志物发现、诊断蛋白组、功能蛋白组、分子成像和微生物鉴定以及个体化诊疗基因分型上的应用日益广泛。如Bruker Daltonics已经开发出了应用于体液或组织样品中多肽和蛋白生物标志物的分型、发现、鉴定和确证的独特的ClinProt（TM）解决方案，该解决方案很好的将不同磁珠表面强有力可重复且可批量的样品制备、高性能的MALDI-TOF和TOF/TOF分析、先进的分析和可视化软件包有机高效的结合在一起，而用于生物标志物发现、诊断蛋白组、功能蛋白组、跟踪人体生理状态变化等。
先进的autoflex II MALDI-TOF（/TOF）质谱仪是ClinProt解决方案的关键部分，autoflex II系统拥有每天最多处理几千份试样的处理能力，是一种高性能的用于预先发现与甄别生物标志物、功能基因组与蛋白质体的全天候系统。ClinProt解决方案可以在蛋白质生物标记的制备、测量、发现、确认和鉴定等方面，为科学家提供全新的解决办法，其中的ClinProtTools软件，可以使科学家对大量样品进行相对快速的扫描，其数据显示特性和群集运算，是改进数据采掘的强大工具，它们可以把杂乱的原始数据还原成富含信息的内容目录。MALDI- TOF质谱仪作为一级体外诊断（IVD）医疗设备在韩国医疗机构进行了注册并获得认证后，韩国的一家新兴的分子诊断公司以及生物医学业中的领导企业现在正在使用autoflex II，凭借GeneMatrix拥有专利的限制性片段质量多态性（RFMP（TM））技术，能够进行包括抗拉米夫定乙型肝炎病毒（HBV）、丙肝病毒（HCV）基因与人类乳头状瘤病毒（HPV）基因在内的分子诊断。韩国众多大型医疗中心与大学、医院都早已经采用了GeneMatrix的测试服务。
又如MALDI- BioTyper（TM）蛋白指纹微生物鉴定系统可以实现细菌、酵母和真菌等微生物的分类和鉴定，从而可以应用到传染病研究和其它微生物应用上。在俄罗斯获得医疗器械注册和认证后，配备有MALDI-BioTypers的microflex 和ultraflex仪器已经被莫斯科物理化学医学院的Vadim Govorun教授用来开发临床相关微生物鉴定和表征的独特系统。Govorun教授说：“非常高兴听说了Bruker Daltonics的MALDI-TOF 平台获得了医疗器械认证。这使我们能够利用该仪器平台按照Bruker Daltonics最新体外诊断应用方案开发有效的俄罗斯人诊断方案。我们打算利用MALDI BioTyper诊断传播性疾病、呼吸道感染和血液感染并检测相应的细菌抗生素抗性。”
Bruker Daltonics市场支持总监Alexander Harder评价说：“总的来说，这是一个把质谱仪应用到临床和体外诊断的重要机遇。尤其是在俄罗斯，健康局已经公认了在医院传染疾病控制中利用我们的 MALDI-BioTyper获得的清晰的微生物鉴定对于改善病人的健康提供了极大的潜力。”Bruker Daltonik公司和欧洲规模最大的生物资源中心——德国微生物菌种保藏中心（DSMZ）联合宣布将利用MALDI-TOF肽及蛋白分析质谱对微生物进行分类和鉴别。DSMC将利用Bruker Daltonik公司的CLINPROT BioTyper蛋白质组学分析系统进行蛋白分析获得包括微生物应用领域（比如微生物鉴别、传染性疾病临床诊断和研究，以及环境分析、食品安全和水质检测等方面）的微生物物种和菌种数据。
另外，MALDI-imaging质谱分子成像系统是一个实现肿瘤区域样品的组织切片和细胞簇中多肽和蛋白生物标志分布的体外成像的独特系统，这满足了在生物学、病理和诊断研究中蛋白生物标准的空间分布的高灵敏成像的需求。还有MALDI-TOF质谱基因分型系统用于SNP的检测，并与代谢组学及生理组学和药理蛋白质组学相结合，更能反映个体的差异及迈向“度身订做”的个人化治疗，从而应用于疾病的分子分型，进行个体化诊疗医学，迎接个人医学的时代。
MALDI-TOF MS致力于解决当前蛋白组学中以下几种潜在的挑战，即生物标记物的发现、分子诊断研发、蛋白质高通量分析和蛋白质组图谱，但绝不局限于此，MALDI- TOF MS应用于生物标记物的发现和在分子层次上对疾病机理进行揭示，从而被应用于分子诊断、目标治疗以及个性化用药，将为人们更完整地提示生长、发育和代谢调控等生命活动的规律和严重疾病的发生机理，为人类进行疾病的诊断防治和新药开发提供重要的理论基础。
采用MALDI-TOF MS进行血清等生物样品分离、多肽谱快速扫描和疾病特征峰测序，研究人类重要生理和病理过程中重要生物标志物谱实验确证和分析技术，可获得若干与人类重大疾病相关的重要生物标志物谱，应用于重大疾病的早期预警和病程判断。如用于发现恶性肿瘤血清标志物谱，创建具有自主知识产权的我国常见恶性肿瘤人群的“血清质谱多肽谱”，获得肿瘤早期预警、病程判断的质谱数据标准，发展用于“血清质谱多肽谱”疾病相关数据挖掘的生物信息学工具和疾病诊断软件，可应用于临床并推向市场。无论对于科研领域、医疗系统，还是生物市场皆具有广阔的前景。

展望
MALDI-TOF MS由于具备快速分析、操作简易、自动化、样品用量少和高通量等特点，可直接检测血清、血浆、尿液、脑脊液、关节腔滑液、支气管洗脱液、细胞裂解液、组织提取物和各种分泌物，应用MALDI-TOF MS形成规模化的重大疾病、重要生物资源的蛋白质组学、蛋白质组指纹图谱或质谱肽图研究技术平台，可建立具有独立知识产权的蛋白质组数据库，发现疾病的相关蛋白谱和具有重要应用前景的生物标记分子谱，以揭示疾病的发生机制，作为早期诊断、分子分型、疗效及预后判断的依据，并找出可能成为新药设计的分子靶点，为疾病提供新的治疗方案。基于MALDI-TOF MS的蛋白质组图谱、质谱肽图、生物标记物谱等分析诊断的发展将是分子医学领域的一场革命，它不仅提供了一种新的诊断方法，并且具有很高的可行性，它可在数分钟时间内从微量血液中测出上万个结果并对其进行分析。对于医学分子诊断领域，MALDI-TOF MS可能将引领分子诊断的科技潮流，主导分子诊断的新时代！