|
实验题目：免疫印迹（Western blotting）
教 师：XXX
实验类型：综合
学 时：16 (参考)
内 容：
一、实验目的：
免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：
蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)并从胶上转移到硝酸纤维素膜上。2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、 试剂与器材：
试剂:
(1)人IgG免疫兔的抗血清；
(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；
(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；
(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；
(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；
(6)底物溶液：
A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；
B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；
C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；
D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；
(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
器材:
(1)半干转移槽；
(2)电泳仪电源：直流稳压，500 V，150 mA。
四、操作方法：
1、SDS-PAGE
将待检测的抗原粗提取液、纯化过程中的样品或纯化后的样品以及标准相对分子质量蛋白质等用SDS-PAGE分离。
2、转移蛋白质到硝酸纤维素薄膜上
(1)准备转移缓冲液。
(2)切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素薄膜，并用转移缓冲液浸湿，放置15 min直到没有气泡。
(3)切割8张普通滤纸，其大小与胶尺寸大小相符，并将其浸泡在有转移缓冲液的培养皿中(与硝酸纤维素薄膜分开浸泡)。
(4)电泳后，切取有用部分的胶，并很快地在转移缓冲液中洗涤。
(5)打开蛋白质转移槽的盖板，依次放入：
①4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
②用转移缓冲液洗过的胶，并小心地赶走滤纸和胶之间的所有气泡；
③放上硝酸纤维素膜；
④另4张用转移缓冲液浸泡过的滤纸；
(6)小心地合上转移槽的盖板；
(7)插入电极，注意正负极方向(硝酸纤维素膜面向阳极)，打开电泳仪开关，调至胶的面积(cm2)×O．8 mA，1．5～2 h。
(8)转移结束后打开盖板取出硝酸纤维素薄膜。
3、免疫印迹膜的处理
(1)用PBS缓冲液洗膜5～10 rain。
(2)将膜用封闭溶液封闭，用摇床轻摇(37℃)60 rain。
(3)用PBS缓冲液洗膜3次，每次10 rain。
(4)将膜置于第一抗体溶液(小牛血清免疫兔的抗血清，1：10)中，置摇床上轻摇，37℃摇动2 h或4℃过夜。
(5)去掉第一抗体溶液，并用PBS洗膜3次，每次10 min。
(6)将膜置于辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液(1：500)中，37℃轻摇2 h。
(7)去掉辣根过氧化酶一羊抗兔IgG溶液，并用PBS-T洗膜3次，每次10 min。
(8)最后用PBS溶液洗，以转移Tween-20。
(9)加底物溶液反应2～10 rain，至抗原区带显色清楚为止。
(10)用去离子水洗涤，以终止反应。将膜夹在滤纸间，干燥。置暗处保存。
另外，加底物溶液的显色反应，亦可用增强化学发光法(enhanced chemiluminescenceECI。)代替，以增加其灵敏度，即将膜经ECL kits处理后，用放射自显影法在X-光片上留下清晰的图像。
五、关键步骤与注意事项：
1、注意安全，一些试剂对人体有害，如丙烯酰胺、放射性同位素等
2、避免样品污染
六、思考题：
酶联免疫吸附测定和蛋白质印迹，在操作方法及应用上有何异同点？
上一篇：PCR专题 下一篇：单克隆抗体的制备
|
