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37) 色谱兄能否推荐几种不错的离子交换介质呢？我现在知道有羧甲基纤维素，sp-sepharose等，但是砝码西亚的sp-sepharose太贵了，450/25ml。你能推荐一下比较不错的介质吗？物美价廉的，谢谢！
维素不好操作,还是用琼脂糖的吧.我用的是国产的.你可PM你的邮件给我.我给你相关的材料.
38) 一是电泳后凝胶里面德蛋白质有什么可靠的方法回收？
二是我现在有个GST融合蛋白，用thrombin酶切后的目的蛋白条带很弱，请问可能是什么原因有什么办法解决
还真没有做过,你可以用电洗脱的方法,然后浓缩可以用离子交换不就行了或者透析袋加PEG8000浓缩,只怕这样会变性了.
你酶切带弱,那可以尝试增加酶的量,或延长酶切时间,.此外看有pH有没有问题,你的蛋白浓度是不是太低.
39) 我所说的大颗粒是指蛋白或病毒颗粒。这些颗粒的直径会大于填料的孔径。谢谢！
完全没有问题,我用琼脂糖凝胶6B给病毒除过盐,也纯化过,这样可以把很多小分子的蛋白去除,再过离子交换就可以比较纯了病毒.病毒都可以,那大分子的蛋白也没有问题,包括质粒也可以用凝胶过滤纯化.
40) 谢谢chromatography的答复。介质有现成的，但很贵啊。我要分离谷胱甘肽还原酶，文献都是用2',5'-ADP－Sepharose 4B纯化，以后你多留意点，
别客气,我的意思是你用兰色琼脂糖凝胶试试,此外有谷胱甘肽琼脂糖,应该也可以用来纯化谷胱甘肽还原酶吧,或者专门合成一个类似底物的也可以,其实你完全可以自己合成填料的.也许这样能很好地解决你纯化的问题.
41) 我用环氧氯丙烷活化琼脂糖，到哪儿可以买到现成的苯甲脒琼脂糖凝胶？GOOGLE 搜不到。我们没冷室，层析过程加什么来抑菌？我将层析柱放冰箱里层析以防长菌和防酶降解，可以吗？
环氧活化的琼脂糖凝胶你要偶联什么配基呢，我有国产甲脒琼脂糖凝胶的材料，你pM你的邮件，我把材料发给你，层析过程水是流动的，所以不会长菌，不需要抑菌，层析柱灌满20%的乙醇，放在冰箱4度中保存很久都没有问题。
42) 查尔酮合成酶的酶活要用同位素方法测定，而我的条件没办法测所以需要送到别的地方测。这会造成很大的麻烦，请问chromatography 有没有人做过的，有没有好的方法可以借鉴？另外一个问题是：利用分离纯化这个蛋白的填料中有没有亲和偶联剂？我一直都没有查到过。
这个酶应该和查尔酮以及苯基酮都有特异的亲和力,你完全可以自己合成一些亲和填料,我们用的是国产活化好的琼脂糖凝胶合成不少亲和介质,效果不错,我觉得你可以用亲和的办法,即使是苯基琼脂糖凝胶也可以纯化这个蛋白.因为它和芳香环有很特异亲和力.
你说的亲和偶联剂是配基还是活化的填料呢.
43) 请问，如果所提蛋白质浓度低，如何进行浓缩或纯化。我试过丙酮沉淀法，但沉淀很难溶解，没法往下作了。有没有更好的方法？谢谢！
那你直接把你的样品放在透析袋中，然后在外面用PEG8000粉末浓缩，这样就好了，你也可以超滤浓缩。丙酮沉淀要在低温搅拌情况下缓慢加冷丙酮，避免局部浓度过高，此外沉淀后马上离心，这样也可以避免变性而不溶解。
44) 三氟乙醇我的看法是降低了极性,这样你的蛋白不会因为(环境极性大)疏水相互作用太强和聚集,至于活性那你多查文献看有没有别的测法了.
关于TFE对于a-helix的形成，现在有两种观点。
1。TFE能稳定a-helix的形成，及这个蛋白本来就是a-helix的结构，但是由于dynamic太严重了，或其他的因素，造成表观上看不见。加入TFE能够稳定之，使之表观可见，用CD啊什么可以看得到。
2。TFE能使蛋白变成a-helix。及这个蛋白本来不是a-helix的，但是由于加入TFE的作用，使之变成a-helix。
具体的原理我就没仔细读了，不过这两方都有一定的文献证明，现在还不知道谁对！ ^_^
45) 我是需要在兔肝中纯化一种酶,而且我是刚刚接触蛋白纯化我有几个问题想请教:
1 : 我的目的蛋白在强阴离子柱上结合(buffer : 25 mM 磷酸盐 PH 7.4),但是似乎结合力很弱(因为上样时就有少量蛋白flowthrough,而且洗脱峰在电导值刚开始升高时就开始出现了),我换用了20mM Tris PH 8.2 buffer 之后,蛋白的结合力好像还是很弱,洗脱峰没多大改变.请问我用 PH 8.5 Tris buffer 会改善我的问题么? 2: 由于目的蛋白丰度低易失活,而且实验室浓缩的条件有限,我过了脱盐柱和粒子柱后样品蛋白含量低体积大,我想请教:我接下来大体积上疏水柱能行么?会很大的影响我的分辨率么?我的蛋白在疏水柱上结合力很强,总是到梯度最末才洗出来,我该怎样优化一下?
3:我有亲和胶(red A) ,但是由于经济上的原因不能用特异的含配体的溶液洗脱,只好用高盐的洗脱液(含2M KCl),这样是不是分离效果很差?值得我去用梯度洗脱么?(因为我没有空柱,上不了机器,只能用手工做,这样做梯度很是麻烦)
4:天然的肝脏匀浆梯度离心后,在PH 7.4 的磷酸盐平衡液下,为什么绝大部分(95%以上)蛋白都结合不上去呢?我最好要把PH值降到多少去试?6.8合适么?
谢谢你的指导!!
1.你可以用5-10mM缓冲液上柱子,同时pH调为8.5,这样可能会好些,此外如果还是很弱,那你可以用Q柱试试.提高pH应该有用,但是有的蛋白吸附力弱,所以盐一高挂不住,因此要降低到5-10mM也许能更好点.
2.大体积直接上疏水没有问题,既然你的目标蛋白是最后出来,那你可以用0.5-1M盐洗去杂质,然后用0.1M洗脱,根本不需要走梯度,这样快,分离效果也不差,而且这样洗脱的体积小,容易放大.
3. 你说的Red A 是procion red HE-3B吗,是染料亲和吗,既然这个填料可以,那么蓝色琼脂糖凝胶也可以,它们都属于染料亲和,这个应该更便宜点,洗脱用盐没有关系,不需要竞争洗脱, 何况那样染料很难去干净.手工洗脱,你可以用阶段洗脱的方法,如你用0.5,1,1.5,2M的盐阶段洗脱就可以,不需要走梯度,只要你多摸索,你会找到个合适的浓度,效果一样很好,没有问题. 4.挂不上你是指的亲和还是离子交换呢,我想如果是亲和,那你可以降低pH,同时还一个缓冲体系,我觉得主要在pH,你降低到4-5那挂得就比较好一些吧.
46) 1.我正是用的Q柱出现的上述问题,
2. red A 确实是一种染料亲和,
3.我说的挂不上是在souce 30 S 和streamline sp上样的体积
4.你用akta的设备么?我用purifier 100 ,发现电导值总是稍迟于开始的梯度.
1,那你按我提议试试吧,降低缓冲液浓度,提高pH值.
2.那它的结构和我说的那个染料是一样的吗,你也可以试试蓝色琼脂糖凝胶,都是颜料,结构也相似.
3,挂不上那也可能,不知道你挂的是用什么条件,这个酶等电点是多少呢.
4.AKTA就是那样的,因为梯度是从一开始就算,而电导至少要近一个柱床体积才有变化,所以稍迟.
47) 你可以先把缓冲液pH调到6试试能不能挂柱，此外其实你的蛋白分子量很小，杂质应该大多分子量比它大，你直接过sephadex G50那么大于30kd的很快就出来，或者上superdex 30 大于10KD的先出来，而你要的在后面，然后你再用离子交换试试，S-100分离范围比较宽，去杂质没有前面说的那两种好，此外你凝胶过滤后可能含盐那也挂不住，因为这样小的分子盐会和蛋白一起出来的，你测定样品的电导看看。
硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，你可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，你可以设计你的实验，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。
多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差？
48) 有可能还在柱子上,如果你所有的组分都检测了没有活性,那这样的可能性很大,你可以用0.5,1M的NaCl分别洗脱,再测定这两个洗脱组分的活性看看.你的酶稳定吗.
我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
49) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
50) 多谢你的回复，但是我把缓冲液PH 调到5.6，我的目的蛋白仍挂不上 SP柱（我是一个新手，正在做蛋白纯化．我的目的蛋白是以可溶形式表达，MW=６KD,理论等电点为9.45．，无tag．我先用S-100除去了部分杂蛋白，但接着再用阳离子交换柱SP分离（２０mM PB ph=7.00），发现目的蛋白根本挂不上．），是不是理论IP与实际有相差?
理论上的和实际是有差别，但是不会这么大，你的样品中盐的含量高不高呢，有盐也会挂不住的。
51) 我的酶还算比较稳定，４C下活性至少三天不丧失，也有报道一周不改变，－２０C时间就更长了。
我分别用了０．５Ｍ，１Ｍ的NaCl洗柱子，测蛋白浓度还是很低，中间有几个管浓度较高，然后测酶活却发现活性依然很低，上柱前测的还有４４１IU／１０ｕｌ，而收集管里的顶多只有２０IU／５０ｕｌ。
所以，我很怀疑它到底挂在柱子上没有，于是我检测了一下上柱后用初始缓冲液洗脱下来的收集液，发现酶活居然有１００IU／５０ｕｌ，我想是不是初始缓冲液的离子强度就太高了呢，０．０１１Ｍ柠檬酸－氢氧化钠，PH５．５？然后就用的是手工步进式洗脱，０．０５Ｍ，０．１Ｍ，０．１５Ｍ，０．２Ｍ，０．２５ＭNaCl，直到后来的０．５Ｍ，１Ｍ．
另外，我还想请教您：
阳离子层析柱用完后如何保存？先用１M氢氧化钠溶液，然后再用含硫柳汞的缓冲液，行吗？可不可以用其他的防腐剂呢？如有，可否推荐一下？硫柳汞我这里包装大，２５ｇ，又不能分装，需要避光保存，先谢谢了！
那用更高点的盐洗脱看看，例如2M，如果还是没有下来，那也许是沉淀在柱子上了，可是如果吸附，你的穿透应该活性很小才是，可是穿透好象有不少，是不是没有挂住呢。
保存你用20%的乙醇过柱子就可以，然后在低温4-8度就可以，没有必要用硫柳汞。
52) 问一个可能是比较业余的问题，现在我想通过真核表到得到纯的蛋白，然后打单抗，但是很多人告诉我真核表达最大的问题就是得到的蛋白非常难纯化，很多人都这样说，所以科室里就没有人去试，实际上我觉得通过真核表达得到纯蛋白是最好的途径，所以想问一下，怎么样能把真核表达的蛋白纯化出来，谢谢。
纯化和表达系统有一些关系，但是最重要的还是看蛋白的特性，所以不一定真核就不好纯化，所以我觉得不用担心。纯化的方法你可以用离子交换等纯化方法，具体很难说，得看你的目标蛋白而定。
53) 你好,我想请教一下,我现在在做包涵体蛋白的柱上复性和纯化,是上的疏水柱.疏水上柱要求硫酸铵的浓度在1.75M以上,但是高浓度的硫酸铵在6M的盐酸胍中不能溶解,不知道你是否碰到过这类问题.而且我的蛋白又不能用8M的尿素溶解.缓冲液现在用的是50mM的磷酸二氢钠,PH7.5.还想请教一下,上样的浓度有要求么?不知道你有什么好的建议呢,谢谢.
要复性你的蛋白浓度就不能高，这样你溶解你的目标蛋白也就不需要那么高的盐酸胍了，这样你就可以把盐浓度提高点。上样浓度应该小于0.1mg/ml，具体情况得看你的蛋白，我建议你可以用简单点的稀释复性或者透析试试，如果不是特别复杂的复性最好能用简单的方法，别过柱子。
54) 不好意思，什么叫穿透啊？不懂唉，请指教。
另外，我还想问一下“交换纤维素解离基团的pK值”？，“用阴离子交换纤维素时要选用低于pK值的缓冲液，用阳离子交换纤维素时要选用高于pK值的缓冲液。”是什么意思，谢谢！
所谓穿透就是上样后用及平衡缓冲液洗下来没有被吸附的部分叫穿透,pK值用于表示酸碱性的强弱,阴离子交换的填料是碱性的,所以你需要用用缓冲液pH小于 pK值这样它才能带正电荷,用于交换带负电荷的样品,否则就挂不上样品.而阳离子是需要缓冲液pH高于pK值,这样它才能解离带负电荷,用于吸附带正电荷的样品.否则也挂不住.
55) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
这样纯化的蛋白可以免疫动物,没有问题
56) 向您请教一个问题，我用pET28载体、宿主菌BL21(DE3)表达目的蛋白，目的蛋白的两端都带His-tag,蛋白的大小为37kD，在利用Ni- NTA纯化时总是在目的蛋白带旁边伴随一条带去除不了，请问有什么高招可以解决这个问题？!!!此外，该表达产物为包涵体，请问这种产物可不可以直接用来制备抗体？谢谢！！！
也许这两个都是你要的目标蛋白呢,会不会是这样呢,你可以用his的抗体做WB看看是不是这样的,如果是,那说明是这样的情况.此外你可以再平衡缓冲液中加0.5%的吐温等表面活性剂,这样可以去除一些非特异吸附,此外你可以用pH45左右的变性溶液去洗,这样也能去掉一些杂质,最后在用咪唑溶液洗脱.如果你这样都去不掉,而做WB也有两条带,那说明可能是降解,超声破碎的时候功率别太大,时间也别太长,注意温度,因为超声有时候也可能会使蛋白降解.
57) 我做得GST融合纯化，目的蛋白在66KD附近，但每次纯化出来的总有杂带，特别是最近的一条带，浓度较大，不论降温还是改变诱导剂浓度始终去不掉，您有什么高见，谢谢。
你可以在你的平衡缓冲液里加一些盐,0.2-0.5MNaCl,这样可以降低一些因为离子作用带来的非特异吸附.同时在平衡液里加0.5%吐温等表面活性剂,这样是不是有点改善,此外你也可以用阶段洗脱的方法,例如用5mM和10mM还原谷胱甘肽去分别去洗脱,这样看看有没有什么区别.此外还要注意的问题是超声破碎时注意功率和时间.避免过强时间过长,降解蛋白.
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