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任何聚合酶尽管它们有能力合成长片段DNA，但却不能将裂缝中相邻的3'－OH和5'－P连接成磷酸二酯键，只有连接酶（DNA ligase）才能做到这一点。其作用机制是分三步进行：
1、ATP（NAD） 与酶结合产生E－AMP＋ppi
ET△＋ATP→E－AMP＋ppi
在E.coli中， E(酶)＋NAD→E－AMP＋NMN（烟酰胺单核苷酸）
2、E－AMP上的AMP转移到DNA的5'－PO4上使其活化 3、活化的5'－PO4与相邻的3'－OH作用形成3'－5'磷酸二酯键，并释放出AMP。但连接酶不能连接单链，必须要有模板的存在。也不能连接3'－OH和5'－PPP以及DNA与RNA。在后滞链的合成，DNA损伤的修复，重组及转座中DNA连接酶都发挥着重要的作用。
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