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人类基因组全部测序完成后,科学家已经开始从整体上通过全面认识基因组的转录和表达来揭示生命活动的规律和机制。基因的转录是生命活动的关键环节,也是生命活动中最为复杂和关键的步骤。例如,肿瘤的发生发展,转移与复发,细胞的生长分裂,组织的发育与分化均涉及到一系列基因的时空变化,是一个基因相互作用的过程。基因与环境相互作用的复杂网络,必须首先通过全基因组转录水平的定量检测和差异比较入手,才能寻找和发现研究的对象所在。
基因芯片技术的诞生为系统和全面研究基因的转录提供了有效工具,通过基因芯片技术可以高通量检测人类几乎所有基因的转录状态,比较不同细胞、组织,不同发育阶段和不同生理病理状态、不同环境和治疗药物反应的基因转录表达情况,从而阐明各种生命活动和疾病的规律及其分子机制。
美国ABI公司最近推出了全球第一张高灵敏度定量的化学发光全基因组表达谱芯片, 该芯片根据人类基因组计划的领头羊Celera 公司的Celera Discovery System数据库和公共数据库的全部人类已知基因(27,868个) 设计制造。
基因芯片很重要的是基因转录的相关信息的获取和分析,这需要庞大的基因信息数据库支持,而ABI公司的基因芯片由于有了Celera公司在人类基因组计划研究中的积累,在基因生物信息方面具有显著的优势,所有探针对应人基因组的特定基因,每一个差异表达的结果都可以在数据库中找到完整的注解,因而对生命活动的认识和分析具有及其重要价值。
与普通cDNA探针和短的Oligo探针不同,该芯片采用最新一代的60个碱基的探针,剔除了大多数的假基因,探针设计选择基因变异最大区域3’UTR区域,同时也兼顾覆盖基因的保守区域,每个探针长度为60个碱基,大多数基因采用1个探针,少数基因采用2-4个探针。这种设计特异性高,杂交信号强度更强和稳定,杂交温度更易于控制,提高了基因检测的灵敏度和特异性,能够准确检测低丰度的基因转录。
与其他基因芯片不同的是,该种芯片采用化学发光技术检测杂交信号。化学发光检测灵敏度较常用的荧光检测提高近100倍,因此,这种芯片号称是目前世界上最灵敏的基因芯片,特别适合低丰度微量基因表达及其变化的检测。
虽然基因芯片为全面认识基因组的转录提供了一种可能,但还是一种较为宏观、粗略的全貌图,通过基因芯片的转录比较,可以将大多数没有显著变化的基因排除在研究视野之外。但是,对于感兴趣的变化显著的基因,还不能简单认同,以防假阳性结果。目前,普通的基因芯片研究结果已经很难直接发表论文,基因芯片所提供的基因转录信息需要通过Northern 杂交或荧光实时定量PCR结果进一步验证和确定。但是现有Northern杂交技术和实时定量PCR技术都存在技术要求高,操作复杂,验证通量小的缺点。一般只能针对少量基因进行验证,面对芯片检测筛选出的众多差异表达基因有时难以选择和取舍。
美国ABI公司针对芯片检测结果的验证和高通量的基因表达定量的科研需要,推出了基于荧光实时定量PCR技术的低密度表达谱芯片。
低密度表达谱芯片是一张含有384个孔的密封的微流卡,每个孔里放入针对特定基因定量检测的PCR扩增引物,荧光探针,可以同时检测一个生物样本的384个基因定量表达情况,每个基因内部均设有内对照。由于芯片卡设有8个加样孔,因此也可以比较检测8个样本的48个基因的定量表达状况。这种芯片卡中所选择的基因用户可以根据自己科研需要向ABI公司订购。目前,ABI公司已经能够满足客户从基因组数据中对人,小鼠和大鼠基因选择的要求,客户可以根据自己研究的需要,选择特定基因的引物、探针进行表达分析。由于该芯片采用的是荧光定量PCR检测技术(也称为Taqman技术),所得到结果的灵敏度和准确性是无可比拟的,灵敏度比通常的基因芯片提高10,000倍,准确性和重复性好。Taqman低密度芯片可以准确检测基因转录水平,为进一步研究提供了准确无误的候选基因。
在深入研究其功能时,需要在不同的细胞组织中,在不同的发育阶段、不同的生理和病理状态、不同的干预状态以及不同的个体中进行比较该基因的转录水平,特别是后者这种情况下,需要检测的样本数量大,Taqman低密度芯片检测基因数量虽然多,但是可以检测的样本数量有限。针对基因表达研究的需要,美国ABI公司立足于Celera的全基因组数据库,开发了共计40万种Gene Expression Assay试剂盒。人、大鼠和小鼠基因组的每一个基因都有4个特定的基因表达检测试剂盒针对性的检测基因不同转录子的表达情况。科学家需要研究哪一个基因、转录子的表达情况,就可以直接购买针对该基因的表达试剂盒,完全省去了设计、合成引物探针,优化实验条件的烦琐步骤,使广大科学家可以集中更多的精力于科研的方向,而不是烦琐的细节。
生命活动的认识过程是一个从单个基因到全基因组,再从全基因组到单个基因循环螺旋上升的过程。每一个循环,让我们又一次加深了对生命活动规律和疾病的分子机制的认识。 ABI公司在转录水平上从基因组到单个基因检测的个性化设计为广大科研人员提供了一条方便之路。 |