摘要：胶质纤维酸性蛋白是星形胶质细胞中的一种标志蛋白，它在神经元内环境的维持和血脑屏障中起着重要作用。本文主要运用生物信息学的方法，对呈现在双向电泳凝胶上、并用质谱鉴定出来的胶质纤维酸性蛋白进行了初步分析，从而对其性质有一个全面的了解。
　　胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP) 是星形胶质细胞中的一种标志蛋白，它参与神经元内环境的维持和血脑屏障。在脑损伤的炎症中会出现以胶质纤维酸性蛋白为特征的纤维化。这种纤维化形成“疤痕”，有隔离和控制细胞外液的离子和分子成分(如K+，神经递质等)的作用。
　　蛋白质组学的方法是系统化地研究蛋白质性质的一把利器。双向电泳、质谱和生物信息学是蛋白质组学的三个基本技术平台。从人脑组织中提取蛋白，然后进行双向电泳，切蛋白点，胶内酶切后进行质谱鉴定，发现在双向电泳图谱上，胶质纤维酸性蛋白并不是与单个点相对应，而是令人吃惊的对应着50 多个点，这主要是由于基因的拼接和翻译后修饰造成的。正是由于胶质纤维酸性蛋白以多种形式存在，从而使其能够非常灵活的参与生理活动的调节。本文主要运用生物信息学的方法对胶质纤维酸性蛋白进行了初步分析，得到了蛋白质组学研究中感兴趣的一些蛋白质基本参数，包括分子量、等电点、氨基酸残基的组成、疏水性、跨膜区、三维结构、亚细胞定位、基本功能等基本信息，并通过blast 找到其同源序列，建立了进化树。
　　首先选择Swissprot，进行SRS Quick Research，搜索GFAP，种属选择Human，
部分信息如下：
ID GFAP_HUMAN STANDARD; PRT; 432 AA.
AC P14136;
DT 01-JAN-1990 (Rel. 13, Created)
DT 01-JAN-1990 (Rel. 13, Last sequence update)
DT 10-OCT-2003 (Rel. 42, Last annotation update)
DE Glial fibrillary acidic protein, astrocyte (GFAP).
GN GFAP.
OS Homo sapiens (Human).
OC Eukaryota; Metazoa; Chordata; Craniata; Vertebrata; Euteleostomi;
OC Mammalia; Eutheria; Primates; Catarrhini; Hominidae; Homo.
OX NCBI_TaxID=9606;
DR EMBL; J04569; AAA52528.1; -.
DR EMBL; S40719; AAB22581.1; -.
DR EMBL; M26638; AAA52529.1; -.
DR EMBL; BC013596; AAH13596.1; -.
DR EMBL; BC041765; AAH41765.1; -.
DR PIR; A32936; A32936.
DR HSC-2DPAGE; P14136; HUMAN.
DR Genew; HGNC:4235; GFAP.
DR MIM; 137780; -.
DR GO; GO:0005882; C:intermediate filament; TAS.
DR GO; GO:0005200; F:structural constituent of cytoskeleton; TAS.
DR InterPro; IPR006821; Filament_head.
DR InterPro; IPR001664; IF.
DR InterPro; IPR002957; Keratin_I.
DR Pfam; PF00038; filament; 1.
DR Pfam; PF04732; filament_head; 1.
DR PRINTS; PR01248; TYPE1KERATIN.
DR PROSITE; PS00226; IF; 1.
KW Intermediate filament; Coiled coil.
FT DOMAIN 1 72 HEAD.
FT DOMAIN 73 377 ROD.
FT DOMAIN 378 432 TAIL.
FT DOMAIN 73 104 COIL 1A.
FT DOMAIN 105 115 LINKER 1.
FT DOMAIN 116 214 COIL 1B.
FT DOMAIN 215 230 LINKER 12.
FT DOMAIN 231 252 COIL 2A.
FT DOMAIN 253 256 LINKER 2.
FT DOMAIN 257 377 COIL 2B.
SQ SEQUENCE 432 AA; 49880 MW; E6C3B3454C3F1250 CRC64;
MERRRITSAA RRSYVSSGEM MVGGLAPGRR LGPGTRLSLA RMPPPLPTRV DFSLAGALNA
GFKETRASER AEMMELNDRF ASYIEKVRFL EQQNKALAAE LNQLRAKEPT KLADVYQAEL
RELRLRLDQL TANSARLEVE RDNLAQDLAT VRQKLQDETN LRLEAENNLA AYRQEADEAT
LARLDLERKI ESLEEEIRFL RKIHEEEVRE LQEQLARQQV HVELDVAKPD LTAALKEIRT
QYEAMASSNM HEAEEWYRSK FADLTDAAAR NAELLRQAKH EANDYRRQLQ SLTCDLESLR
GTNESLERQM REQEERHVRE AASYQEALAR LEEEGQSLKD EMARHLQEYQ DLLNVKLALD
IEIATYRKLL EGEENRITIP VQTFSNLQIR ETSLDTKSVS EGHLKRNIVV KTVEMRDGEV
IKESKQEHKD VM//
　　进入SSH，建立文件GFAP.fasta , 将GFAP 的序列copy 到此文件中。然后用EMBOSS 命令结合一些生物信息学工具进行分析：
1. 统计蛋白质序列“GFAP.fasta”的参数
　　(1) 用pepstats 命令统计蛋白质序列“GFAP.fasta”中各种氨基酸的含量，并得到分子量、等电点、带电荷数以及280nm 光吸收值等有用信息。
pepstats GFAP.fasta
　　输出结果如下：
Molecular weight = 49880.06 Residues = 432
Average Residue Weight = 115.463 Charge = -9.0
Isoelectric Point = 5.2047
A280 Molar Extinction Coefficient = 18490
A280 Extinction Coefficient 1mg/ml = 0.37
Probability of expression in inclusion bodies = 0.781
Residue Number Mole% DayhoffStat
A = Ala 47 10.880 1.265
B = Asx 0 0.000 0.000
C = Cys 1 0.231 0.080
D = Asp 21 4.861 0.884
E = Glu 60 13.889 2.315
F = Phe 7 1.620 0.450
G = Gly 13 3.009 0.358
H = His 8 1.852 0.926
I = Ile 13 3.009 0.669
K = Lys 21 4.861 0.737
L = Leu 56 12.963 1.752
M = Met 12 2.778 1.634
N = Asn 17 3.935 0.915
P = Pro 9 2.083 0.401
Q = Gln 26 6.019 1.543
R = Arg 47 10.880 2.220
S = Ser 23 5.324 0.761
T = Thr 20 4.630 0.759
V = Val 20 4.630 0.701
W = Trp 1 0.231 0.178
X = Xaa 0 0.000 0.000
Y = Tyr 10 2.315 0.681
Z = Glx 0 0.000 0.000
Property Residues Number Mole%
Tiny (A+C+G+S+T) 104 24.074
Small (A+B+C+D+G+N+P+S+T+V) 171 39.583
Aliphatic (I+L+V) 89 20.602
Aromatic (F+H+W+Y) 26 6.019
Non-polar (A+C+F+G+I+L+M+P+V+W+Y) 189 43.750
Polar (D+E+H+K+N+Q+R+S+T+Z) 243 56.250
Charged (B+D+E+H+K+R+Z) 157 36.343
Basic (H+K+R) 76 17.593
Acidic (B+D+E+Z) 81 18.750
　　(2) 为了更加全面地统计各参数， 用expasy 中的工具ProtParam

http://cn.expasy.org/tools/protparam.html)，结果如下：
Number of amino acids: 432
Molecular weight: 49880.2
Theoretical pI: 5.42
Amino acid composition:
Ala (A) 47 10.9%
Arg (R) 47 10.9%
Asn (N) 17 3.9%
Asp (D) 21 4.9%
Cys (C) 1 0.2%
Gln (Q) 26 6.0%
Glu (E) 60 13.9%
Gly (G) 13 3.0%
His (H) 8 1.9%
Ile (I) 13 3.0%
Leu (L) 56 13.0%
Lys (K) 21 4.9%
Met (M) 12 2.8%
Phe (F) 7 1.6%
Pro (P) 9 2.1%
Ser (S) 23 5.3%
Thr (T) 20 4.6%
Trp (W) 1 0.2%
Tyr (Y) 10 2.3%
Val (V) 20 4.6%
Asx (B) 0 0.0%
Glx (Z) 0 0.0%
Xaa (X) 0 0.0%
Total number of negatively charged residues (Asp + Glu): 81
Total number of positively charged residues (Arg + Lys): 68
Atomic composition:
Carbon C 2140
Hydrogen H 3516
Nitrogen N 654
Oxygen O 691
Sulfur S 13
Formula: C2140H3516N654O691S13
Total number of atoms: 7014
Extinction coefficients:
Conditions: 6.0 M guanidium hydrochloride
0.02 M phosphate buffer
pH 6.5
Extinction coefficients are in units of M-1 cm-1 .
The first table lists values computed assuming ALL Cys
residues appear as half cystines, whereas the second table
assumes that NONE do.
276 278 279 280 282
nm nm nm nm nm
Ext. coefficient 19900 19600 19110 18490 17600
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.399 0.393 0.383 0.371 0.353
276 278 279 280 282
nm nm nm nm nm
Ext. coefficient 19900 19600 19110 18490 17600
Abs 0.1% (=1 g/l) 0.399 0.393 0.383 0.371 0.353
Estimated half-life:
The N-terminal of the sequence considered is M (Met).
The estimated half-life is: 30 hours (mammalian reticulocytes, in vitro).
>20 hours (yeast, in vivo).
>10 hours (Escherichia coli, in vivo).
Instability index:
The instability index (II) is computed to be 52.74
This classifies the protein as unstable.
Aliphatic index: 86.60
Grand average of hydropathicity (GRAVY): -0.773
　　2. 用pepinfo 命令以图形方式显示蛋白质序列“GFAP.fasta”中各种不同性质氨基酸的含量。输出结果如下：
　　3. 预测蛋白质序列“GFAP.fasta”的跨膜区。
　　(1) 用tmap 命令预测如下：
由上图可知此蛋白不是膜蛋白，无跨膜区。
　　(2) 为了更直观的显示跨膜区， 可以借助expasy(http://cn.expasy.org/) 中的
TMHMM 工具(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)， 预测结果如下：
# Sequence Length: 432
# Sequence Number of predicted TMHs: 0
# Sequence Exp number of AAs in TMHs: 0.38312
# Sequence Exp number, first 60 AAs: 0.3831
# Sequence Total prob of N-in: 0.05392
Sequence TMHMM2.0 outside 1 432
　　4. 用pepwheel 命令以图形方式显示蛋白质序列“GFAP.fasta”的所有432 个残
基的螺旋轮。输出结果如下：
　　5. GFAP 疏水性的预测：蛋白质疏水性的预测在蛋白质组学研究中是必不可少的，通常根据蛋白质的GRAVY 值来预测。GRAVY 值的范围在2 与-2 之间，正值表明此蛋白为疏水蛋
白，负值表明为亲水蛋白。从通过protparam 工具统计的结果中可知，Grand average of hydropathicity(GRAVY)为-0.773，这说明人源的GFAP 为亲水蛋白。
　　6. 预测GFAP 的亚细胞定位：
通过工具PSORT (http://psort.nibb.ac.jp/form2.html) 进行预测，结果如下：
47.8 %: nuclear
39.1 %: mitochondrial
13.0 %: cytoplasmic
　　7. 预测GFAP 的三维结构：
　　通过SRS 搜索，没有得到GFAP 的PDB 文件，说明此蛋白的三维结构还没有解析出来。用expasy 中的SWISS-MODEL 工具(http://swissmodel.expasy.org/)预测如下：
　　8. 预测GFAP 的功能：
　　用Gene ontology(GO)工具(http://www.ebi.ac.uk/ego/) 预测GFAP 的功能，结
果如下：
　　All annotation for the protein GFAP_HUMAN (P14136).
Select Name GO ID Source Evidence Reference With
function (2)
structural constituent of
cytoskeleton
GO:0005200
Proteome
Inc
TAS
PubMed:
2740350
structural molecule
activity
GO:0005198 InterPro IEA
InterPro:
IPR001664
component (3)
intermediate filament GO:0005882
Proteome
Inc
TAS
PubMed:
2740350
intermediate filament GO:0005882 InterPro IEA
InterPro:
IPR006821
　　intermediate filament GO:0005882 Keyword IEA
　　由上表可知，GFAP 是一个骨架蛋白，是中间纤维的重要组成部分。这与实验所观察到的现象是一致的，在脑损伤的炎症中出现的疤痕正是由于骨架蛋白GFAP 的纤维化形成的。
　　9.多序列比对，并建进化树
首先在NCBI 中BLAST 从而得到许多GFAP 的同源蛋白，然后将同源性较高的5 个蛋白的序列下载为fasta 格式，并把这些序列合并到一个文件中，5 个序列：
>gi|4503979|ref|NP_002046.1| glial fibrillary acidic protein [Homo
sapiens]
>gi|16265836|gb|AAL16662.1|AF419299_1 glial fibrillary acidic protein
[Homo sapiens]
>gi|38566198|gb|AAH62609.1| GFAP protein [Homo sapiens]
>gi|28849921|ref|NP_776490.1| glial fibrillary acidic protein [Bos
taurus]
>gi|417050|sp|P03995|GFAP_MOUSE Glial fibrillary acidic protein,
astrocyte (GFAP)
　　然后用clustalw 进行多序列比对，得到aln 文件，结果如下：
gi|4503979 MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRV
gi|16265836 MERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRV
gi|38566198 -ERRRITSAARRSYVSSGEMMVGGLAPGRRLGPGTRLSLARMPPPLPTRV
gi|28849921 MERRRVTSATRRSYVSSSEMVVG----GRRLGPGTRLSLARMPPPLPARV
gi|417050 MERRRITS-ARRSYAS--ETVVRGLGPSRQLGTMPRFSLSRMTPPLPARV
****:** :****.* * :* .*:**. .*:**:**.****:**
gi|4503979 DFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAE
gi|16265836 DFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAE
gi|38566198 DFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAE
gi|28849921 DFSLAGALNSGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAE
gi|417050 DFSLAGALNAGFKETRASERAEMMELNDRFASYIEKVRFLEQQNKALAAE
*********:****************************************
gi|4503979 LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLAT
gi|16265836 LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLAT
gi|38566198 LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLAT
gi|28849921 LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNLAQDLGT
gi|417050 LNQLRAKEPTKLADVYQAELRELRLRLDQLTANSARLEVERDNFAQDLGT
*******************************************:****.*
gi|4503979 VRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFL
gi|16265836 VRQKLQDGTNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFL
gi|38566198 VRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFL
gi|28849921 LRQKLQDETNQRLEAENNLAAYRQEADEATLARLDLERKIESLEEEIRFL
gi|417050 LRQKLQDETNLRLEAENNLAAYRQEAHEATLARVDLERKVESLEEEIQFL
:****** ** ***************.******:*****:*******:**
gi|4503979 RKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNM
gi|16265836 RKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNM
gi|38566198 RKIHEEEVRELQEQLARQQVHVELDVAKPDLTAALKEIRTQYEAMASSNM
gi|28849921 RKIHEEEVRELQEQLAQQQVHVEMDVAKPDLTAALREIRTQYEAVASSNM
gi|417050 RKIYEEEVRDLREQLAQQQVHVEMDVAKPDLTAALREIRTQYEAVATSNM
***:*****:*:****:******:***********:********:*:***
gi|4503979 HEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLR
gi|16265836 HEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLR
gi|38566198 HEAEEWYRSKFADLTDAAARNAELLRQAKHEANDYRRQLQSLTCDLESLR
gi|28849921 HEAEEWYRSKFADLNDAARRNAELVRQAKHEANDYRRQLQALTCDLESLR
gi|417050 QETEEWYRSKFADLTDAASRNAELLRQAKHEANDYRRQLQALTCDLESLR
:*:***********.*** *****:***************:*********
gi|4503979 GTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQ
gi|16265836 GTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQ
gi|38566198 GTNESLERQMREQEERHVREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQ
gi|28849921 GTNESLERQMREQEDAHAREAASYQEALARLEEEGQSLKDEMARHLQEYQ
gi|417050 GTNESLERQMREQEERHARESASYQEALARLEEEGQSLKEEMARHLQEYH
**************: *.**:******************:*********:
gi|4503979 DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVS
gi|16265836 DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVS
gi|38566198 DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVS
gi|28849921 DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVS
gi|417050 DLLNVKLALDIEIATYRKLLEGEENRITIPVQTFSNLQIRETSLDTKSVS
**************************************************
gi|4503979 EGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM
gi|16265836 EGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM
gi|38566198 EGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESKQEHKDVM
gi|28849921 EGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKESPQEHKDVM
gi|417050 EGHLKRNIVVKTVEMRDGEVIKD---------
**********************:
　　之后，开始建立进化树。主要用到seqboot、protdist、neighbor 等命令，最终生成treefile 文件，用treeview 软件打开此文件，可以得到进化树。
　　由进化树可以看出，人来源的蛋白gi|16265836 和gi|38566198 在进化上距离较近，而本文所分析的人来源蛋白gi|4503979 则距离前两种蛋白较远，牛来源的蛋白gi| 28849921 和鼠来源的蛋白gi|417050 在进化上距离较近，但距离人来源的三种蛋白较远。

结论:

　　通过以上分析，可以得到如下结论：胶质纤维酸性蛋白(GFAP)为一中等分子量的酸性蛋白，分子中含有较多的Glu，每个分子大约带9 个负电荷。该蛋白无跨膜区域，并且亲水，不是膜蛋白。GFAP 是一种结构蛋白，它主要参与中间纤维的构成，在神经元内环境的维持和血脑屏障中起着重要作用。到现在为止，该蛋白的空间结构尚未解析出来。该蛋白还有待于进一步的研究。