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[核酸技术]
实时荧光定量PCR——一种科学准确的定量方法
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日期：2007-02-08 09:04:46
点击：204 评论：0
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| 实时荧光定量 PCR 技术于 1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出，由于该技术不仅实现了 PCR 从定性到定量的飞跃，而且与常规 PCR 相比，它具有特异性更强、有效解决 PCR 污染问题、自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。本文试就其定量原理、方法及参照问题 |
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[核酸技术]
实时定量PCR实验方案优化
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日期：2007-02-08 08:52:59
点击：162 评论：0
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| 由于各家公司生产的热循环仪提供的各种实验方案不太一致，所以优化的策略也不尽相同，然而在各种方案中，前文所述的那些影响实时PCR 反应的因素却总是相通的。只要能较好地控制实验条件，优化实验步骤，要想获得满意的实验结果并不一定都是困难的。下面本文将就影响到实 |
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[核酸技术]
TAIL PCR Protocol
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日期：2007-02-07 12:02:23
点击：179 评论：0
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| TAIL is a series of reactions that are intended to map where a T-DNA (transfer DNA) has inserted within the genome. The main components of the 3 reactions are the AD (Arbitrary Degenerate) primers, border primers, and DNA from the T-DNA lines that ar |
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[核酸技术]
内标对荧光定量PCR的影响
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日期：2007-02-07 11:56:58
点击：139 评论：0
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| 1．实时荧光定量PCR无需内标 实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在 电脑 软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础 |
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[核酸技术]
Protocol for Real-Time RT-PCR
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日期：2007-02-07 10:44:59
点击：176 评论：0
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| This protocol describes the detailed experimental procedure for real-time RT-PCR using SYBR Green I as mentioned in Xiaowei Wang and Brian Seed (2003) A PCR primer bank for quantitative gene expression analysis. Nucleic Acids Research 31(24): e154; p |
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[核酸技术]
使用一步法RT-PCR从单一细胞中检测基因
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日期：2007-02-07 10:42:51
点击：79 评论：0
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| 方法： 分离单一细胞 在去除了细胞培养基后，COS-7细胞用不含钙镁的DPBS（0.20g/L KCl, 0.20g/L KH2PO4, 8.00g/L NaCl, 2.16g/L Na2HPO4·7H2O）清洗一次。加入Trypsin-EDTA(0.25% tryspsin,1mM EDTA·4Na)到细胞中（3ml/75cm2培养瓶）并保温至最多5分钟。加入20ml生长 |
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[核酸技术]
PCR产物克隆
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日期：2007-02-07 10:33:52
点击：126 评论：0
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| PCR克隆主要有TA克隆法, 限制性酶切与连接法，杂交法和近期开发出来的特异性重组法等。 但因为TA克隆法操作最简单，快速和高效的原因，成为Taq聚合酶PCR产物的最佳克隆方法。TA克隆法由Invitrogen发明，并拥有全球TA Cloning商标的专利权。 TA克隆方法（Original TA Cl |
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[核酸技术]
PCR应用
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日期：2007-02-07 10:32:10
点击：86 评论：0
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| 多重PCR 在多重PCR中，同时使用多对引物扩增几个不同的位点。这种复杂的PCR一般会导致低产量，而且需要高浓度的Mg2+。如果没有正确优化，容易出现假阳性。Platinum Taq DNA聚合酶经改良，可以适应广谱浓度的Mg2+，从而提高多组反应成功的可能性（ 图27 ）。 图27. 对于 |
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[核酸技术]
增加PCR特异性
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日期：2007-02-07 10:24:36
点击：84 评论：0
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| 引物设计 细心地进行引物设计是PCR中最重要的一步。理想的引物对只同目的序列两侧的单一序列而非其他序列退火。设计糟糕的引物可能会同扩增其他的非目的序列。下面的指导描述了一个可以增加特异性的引物所具有的令人满意的特点： * 典型的引物18到24个核苷长。引物需要 |
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[核酸技术]
RT-PCR应用
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日期：2007-02-07 10:22:05
点击：212 评论：0
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| 5' 和3' RACE RACE（cDNA末端快速扩增，Rapid Ampliphication of cDNA Ends）是一种获得转录本5'或3'未知序列的方法。不象普通RT-PCR那样使用两个序列特异性的引物，RACE使用一个序列特异性的引物和或者mRNA的poly(A)尾（3' RACE）或者加到cDNA末端的多聚同聚体（5' RA |
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[核酸技术]
增加RT-PCR特异性
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日期：2007-02-07 10:20:45
点击：83 评论：0
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| 起始cDNA合成 第一链cDNA合成的起始可以使用三种不同的方法，各种方法的相对特异性影响了所合成cDNA的量和种类。 随机引物法是三种方法中特异性最低的。引物在整个转录本的多个位点退火，产生短的，部分长度的cDNA。这种方法经常用于获取5'末端序列及从带有二级结构区 |
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[核酸技术]
增加RT-PCR灵敏度
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日期：2007-02-07 10:19:06
点击：86 评论：0
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| 分离高质量RNA 成功的cDNA合成来自高质量的RNA。高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。RNA的质量决定了你能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。一般的RNA纯化方法是使用异硫氰酸胍／酸性酚的一步法。Trizol试剂法（见 下图 ）将一步法加 |
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[核酸技术]
如何建立一个PCR实验室？
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日期：2007-02-07 10:16:16
点击：135 评论：0
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| 为了对以个特定序列进行PCR做重复检测,需要三个不同的区域,每一个区域的具体技术操作和试剂在下面详细列出. 1、样品准备区这个区域专门用作样品的准备，在制备和操作用于核酸提取的试剂时应该采取预防措施：1）PCR产物和带有要扩增序列的DNA克隆不能在这个房间操作。2） |
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[核酸技术]
PCR污染及解决对策
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日期：2007-02-07 10:14:02
点击：112 评论：0
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| 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的方法，在微生物感染的诊断中具有重要的价值。在PCR扩增过程中，扩增的DNA产量是呈指数上升的，经过n个循环的扩增，一个DNA分子的产量便达到2n个拷贝。PCR产物一般为1013拷贝/ml，取0.1m |
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[核酸技术]
PCR反应体系与反应条件
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日期：2007-02-07 10:12:04
点击：138 评论：0
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| PCR反应体系与反应条件 -------------------------------------------------------------------------------- 标准的PCR反应体系： 10×扩增缓冲液 10ul 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 各10～100pmol 模板DNA 0.1～2ug Taq DNA聚合酶 2.5u Mg2+ 1.5mmol/L 加双或三蒸 |
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