用不耐热DNA聚合酶进行PCR产物的测序

　　一些不耐热DNA聚合酶已经用来直接测序体外扩增的DNA。使用Klenow聚合酶，修 饰T7DNA聚合酶(测序酶)及反转录酶来测序。

用Taq聚合酶进行PCR产物的测序

　　Tab聚合酶除了用作PCR扩增外，它还是DNA测序的理想的酶。Tab聚合酶具有高度的延伸能力(processivity)，较高的掺入速率，并可用一些核酶类似物如7-Deaza-2' -脱氧鸟苷-5'-三磷酸来解决DNA测序中的压缩问题。除了这些与T7DNA聚合酶相同的性质外，它有较高的热稳定性，使反应温度可达55-70℃，这可使大量的二级结构解体。可是，对于dNTPs而言，它有一个相对高的Km值(≈10-20μM)并缺乏3'-外切酶活性。当dNTP浓度低于1μM时，它将产生错配和不正确的终止。琼脂和琼脂糖中都有 Tab聚合酶的抑制物，但这些可通过增加测序反应中Tab聚合酶的量(2U-10U)得到部分 解决。当测定克隆插入子的PCR产物序列时时，由噬菌体液裂解制备的靶基因中并不 含有从平板溶解出来的抑制物。

对带有强二级结构的DNA进行测序

　　带有强二级结构的DNA测序可能产生两个问题:1).由于Tab聚合酶不能完全延伸的 模板频率很高，因而降低了PCR的效率，2.).在测序反应中，压缩被测DNA序列的长 度。

　　研究结果表明:在PCR中使用Tab聚合酶(50-70℃)的高反应温度足够解决大部份短的二级结构。但强的二级结构会产生强烈的抑制作用。这些只能通过加入与dGTP比例事适的碱基类似物c7dGTP后，才可解决。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来 解决压缩问题(compression problem)。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用 次黄嘌吟核苷作为碱基类似物。同样的碱基类似物也可用在测序反应中，来解决压缩问题（COMPRESSION）。Tab聚合酶可以有效地掺入c7dGTP，但不能用次黄嘌呤核苷作 为碱基类似物。

PCR扩增DNA测序中涉及到的错误

　　在原始靶基因序列和由它扩增出的PCR产物之间可能有两种不一致情况:1).由点 突变引起的差异;2).由体外重组的等位基因引起的差异。点突变引起的差异是由于 每”个循环中每个核苷酸大约有2×10^-4几率发生错误掺入。经过30个循环扩增后，每 个PCR产物平均在每400-4000个碱基对内存有差异。这个错误掺入的几率有时比 Klenow聚合酶(8×10^-5) 更高。体外重组产生的等位基因(shuffle clone)j是镶嵌PCR 产物，这可能是在以后的循环中由部分延伸的PCR产物造成的，因为它可作为另一个等位基因模板的引物。由于酶量不足以用来延伸所有的模板，使得在以后的反应循环中主要积累这些等位基因。除非杂合体中的两个等位基因在其PCR引物上有几个不同 位点的差异，这些人工产物进不能检测出来的。

　　当用PCR产物来克隆、测序并从一组相同克隆子序列(consensus sequence)推断 出各个等位基因的序列时，就必须考虑到这两种不同类型的错误。相比之下，当PCR 产物用来直接测序时，由错误掺入或镶嵌而产生的错误PCR产物并不影响PCR测序。在各个PCR产物中由点突变引起的差异与相同序列比是检测不出的。既使这个突变(如错误掺入)在以一个DNA分子为模板的如单个精子DNA扩增反应的第一个循环中产生，它也仅占该位点正常核苷酸的25%。对起始DNA模板不止一个的扩增反应，在任一位点上含有一个错配核苷酸的PCR产物的频率低到检测不出的程度。虽然目前并不很了解镶嵌基因形成的条件，但相信这些等位基因是在反应最后几个循环中积累起来的，因为这时酶量可能不足以用来延伸所有的模板。除非序列中有非常强烈的二级结构，在某一特定位点上使链延伸终止，结果产生一个单一的人工基因。镶嵌基因不会影响正常 序列的测定。

测序反应的自动化

　　DNA测序的可重复性使它适合于完全或部分自动化。已有用常规的放射性标记引物，或荧光终止标记或测序引物进行自动化测序的一系列仪器。但是，这些仪器仅使分析的前半部分自动化，凝胶电泳、读带和将序列输到计算机中用后半部分自动化来补足。前半部有两个阶段:模板的制备测序模反应，可很容易地进行自动化反应。用 Tab酶进行PCR扩增和直接测序是制备测序模板和测序反应终产物的最有效方法。一旦使用自动进样器，就可进行自动化反应，仅电泳分析由人工进行。这对许多一直使用 人工电泳测序反应的实验室来说，都将从中受益。