了解叶绿体分离的一般原理和方法，并熟悉应用荧光显微镜方法观察叶绿体荧光现象。

    叶绿体是植物细胞中较大的一种细胞器，能发生特有的能量转换。利用低速离心机可以分离叶绿体，其分离在等渗溶液（0.35mol/L氯化钠或0.4mol/L蔗糖溶液）中进行，目的是为了防止渗透压的改变引起叶绿体的损伤。将匀浆液在1000r/min离心，去除其中的组织残渣和一些未被破碎的完整细胞，然后，3000r/min离心，可获得沉淀的叶绿体（混有部分细胞核）。在室温下进行分离要迅速。

    某些物质在一定短波长的光（如紫外光）的照射下吸收光能进入激发态，从激发态回到基态时，就能在极短的时间内放射出比照射光波长更长的光（如可见光），这种光就称为荧光。若停止供能，荧光现象立即停止。有些生物体内的物质受激发光照射后，可直接发出荧光（称为自发荧光），如叶绿素的火红色荧光。有的生物材料本身不发荧光，但它吸收荧光染料后同样也能发出荧光（称为间接荧光），如叶绿体吸附吖啶橙后可发橘红色荧光本实验利用荧光显微镜对发荧光的叶绿体进行观察。

***材料： 菠菜叶片

菠菜

***试剂：蒸馏水，0.35mol/L氯化钠溶液，0.01%吖啶橙。

***仪器(请参看仪器图库)：普通离心机，组织捣碎机，天平，荧光显微镜，显微镜，载玻片，盖玻片，镊子，接种针，目镜测微尺，物镜测微尺，恒温箱，培养皿，滤纸，试管，试管架，移液管，滴管，烧杯，无荧光载片，盖玻片，离心管。

1.选取新鲜的菠菜嫩叶，洗擦干后去除叶梗及粗脉，称3g于0.35mol/L氯化钠溶液15ml中置 组织捣碎机或研钵中。

2.利用组织捣碎机低速（5000r/min）匀浆，3_~5min，或研磨成匀浆。

3.用6层纱布过滤，滤液盛于烧杯中。

4.取滤液4ML在1000r/min下离心2min，弃去沉淀。

5. 将上清液在3000r/min下离心5min，弃去上清液，沉淀即为叶绿体（混有部分细胞核）。

6.沉淀用0.35mol/L氯化钠溶液悬浮。

7.取叶绿体悬液1滴置于载玻片上，加盖玻片后用普通光学显微镜观察。使用荧光显微镜观察(荧光显微镜使用方法)时，将叶绿体悬液滴在无荧光的载玻片上，再滴加1滴0.01%吖啶橙荧光染料，盖上无荧光的盖玻片后即可观察。

8.观察叶绿体的形态结构、测量1_~5个叶绿体的长轴和短轴、叶绿体发射荧光的现象。

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	叶绿体自发光

1.观察叶绿体的形态结构,测量5_~10个叶绿体的长轴和短轴求其平均值。

2.记录荧光显微镜下观察的叶绿体自发荧光和次生荧光现象，分析结果。

1. 分离叶绿体实验的原理是什么？操作过程中应注意什么？

2.普通光学显微镜和荧光显微镜的原理有何异同点？