体外转录合成单链RNA探针

1.用适当的限制酶消化超螺旋质粒DNA制备5 pmol的线性模板DNA。取一小份消化的DNA（100ng）进行琼脂糖凝胶电泳分析。如有必要，再补加限制性酶进行温育，直至不再残存痕量的未消化DNA。

2.如必须用产生3’突出端的限制酶如Pst I 或 Sst I，则应用噬菌体T4 DNA聚合酶在四种dNTP的存在下处理消化的DNA片段，以除去产生的3’突出端。

3.用酚：氯仿抽提及用标准乙醇沉淀纯化模板DNA。将DNA溶解于水，使其终浓度为100 nmol/L（如3kb质粒为200μg/ml）。

4.将下列前六种组分温育至室温，在一个灭菌的0.5 ml微量离心管中，室温下以下列顺序混合：
                      模板DNA                           0.2 pmol（3 kb质粒为400 ng）
                      无RNA酶的水                                  加至6μl
                      5 mmol/L rNTP溶液                              2μl
                      100 mmol/L DTT                                  2μl
                      10×转录缓冲液                                  2μl
                      2 mg/ml 牛血清白蛋白                            1μl
                      10 mCi/ml[[α-32P] rNTP                           5μl
                      （比活性400～3000 Ci/mmol）
                      轻弹管外壁以使各组分混合。然后加入：
                      胎盘RNA酶抑制剂（10单位）                       1μl
                      噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶（约10单位）       1μl
                      轻敲管壁外侧使反应物混合，离心1~2s以使所有液体沉降到管底。37℃（T3和T7噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶）或40℃(SP6噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶)下温育反应物1~2h。

5.（任选）如需全长转录物，可加入2μl 0.5 mmol/L rGTP, 在适宜聚合酶的温度下再温育60min。

6.加入1μl 1mg/ml无RNA酶的胰DNA酶I以终止体外转录反应。轻弹管外壁以混合各试剂。37℃温育反应混合物15min。

7.加入100μl无RNA酶的水，通过用酚：氯仿抽提纯化RNA。

8.将水相转移至一个新的微量离心管，用下列三种方法中的任一方法将放射性标记的RNA与不需要的小分子RNA和rNTP分开：
                      用乙醇沉淀纯化RNA
                      通过离心柱层析纯化RNA
                      通过凝胶电泳纯化RNA