DNA甲基化和肿瘤

表观遗传学的研究表明，基因组CpG二核甘酸中的胞嘧啶，可以通过甲基化转移酶的甲基化作用调控转录和染色质结构修饰，控制寄生性成分转移，维持基因组稳定性和引起X染色体的失活。细胞DNA甲基化模式的维持对于细胞存活、正常胚胎及出生后发育和成人正常生理功能必不可少。新技术的出现为研究所有生物学组织的表观遗传学模式提供了可能。对肿瘤中DNA甲基化的研究可以用来区分样本的肿瘤细胞，同时也可以用单个或者多个基因启动子的高甲基化来作为肿瘤的预后因子。研究DNA甲基化导致的基因沉默产物可能作为激素或者化疗反应的生物标记分子，而对DNA甲基化抑制剂的研究成为肿瘤治疗新的方向。总之，在肿瘤治疗的研究中，DNA甲基化值得相关领域的研究人员去开拓。

1 DNA甲基化的一般评价

在人类基因组DNA中，约3％～4%的胞嘧啶碱基以5-甲基胞嘧啶形式存在,结果导致在人类正常组织细胞DNA中，5-甲基胞嘧啶占所有核甘酸碱基的0.75%～1%[1～3]。大约70％～80％的5-甲基胞嘧啶存在于CpG序列中，CpG二核甘酸集中的区域称之为CpG岛，这部分通常是未甲基化，这些CpG岛跨过许多基因的5’末端——包括启动子，未翻译区和第一外显子[4]。胞嘧啶的这种修饰在DNA复制后发生，并用S-腺苷-蛋氨酸作为甲基供体由DNA甲基化转移酶（DNMT）催化。有3个独立的带活性的DNMTs：DNMT1、DNMT3a和DNMT3b。DNMT2已经被克隆并赋予特征，但是其催化活性还有待在体内和体外证实[5]。未甲基化的CpG岛与看家基因相关，而某些组织特异性基因会出现甲基化的CpG岛。DNA甲基化与人类细胞DNA的表达相关，建立在基因表达基础上的信息遗传被分类为表观遗传学，这与建立在基因序列基础上的信息遗传即遗传学不同。人类表观遗传学主要的改变就是定位在CpG岛内的胞嘧啶甲基化以及组蛋白的修饰。

DNA甲基化影响人类基因组的效果包括转录抑制，染色质结构修饰和X染色体失活，基因组印迹，抑制重复序列和寄生DNA成分对基因组完整性的损害作用。在肿瘤细胞中基因组甲基化模式常常发生改变，出现整体的低甲基化伴随着特定区域的高甲基化[6]。当肿瘤抑制基因发生高甲基化，造成相关基因表达沉默，并可出现细胞以缺失或者突变的方式恶性生长。

2 肿瘤中DNA甲基化的作用

2.1 肿瘤局部相关基因的高甲基化

2.1.1肿瘤抑制基因沉默肿瘤细胞中包含的高甲基化CpG岛能够显著影响细胞通路，如结肠癌、胃癌中hMLH1基因高甲基化导致DNA错配修复的缺失；脑肿瘤、结肠癌中MGMT基因的高甲基化导致化疗敏感性降低，而去甲基化药物如azzcytidine，地西他宾可再次激活沉默的基因，这也支持了CpG岛甲基化在肿瘤抑制基因的沉默中起着重要作用的观点[7]，且这些药物已经应用于临床的肿瘤治疗中[8,9]。在对肿瘤细胞中特定基因的高甲基化和肿瘤组织的起源进行研究发现，两者有着很强的特异性[10]。但是，目前仍有待研究的是为什么在某些特异性组织起源的肿瘤中，一些基因出现高甲基化，而在其它有类似特征（如有CpG岛，表达缺失和序列无突变）的肿瘤中，这些基因无甲基化。

另外，在对散发性和家族性乳腺癌和结肠癌的研究中发现[3]，家族性肿瘤中序列无突变的10个抑癌基因的启动子区域甲基化常见，但是在突变的抑癌基因中没有发现甲基化现象，这也表明DNA甲基化在肿瘤的发生发展中起着二次打击的作用。

2.1.2 5-甲基胞嘧啶突变和p53抑癌基因失活研究表明[11]，相对于胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，5-甲基胞嘧啶能够以更快的速度自发脱氨基变成胸腺嘧啶。如果5-甲基胞嘧啶的脱氨基不能够有效修复，将会导致C－T突变，这个现象已经用来解释在p53肿瘤抑制基因中较高的CpG－TpG突变率[12]。但也有其它研究表明原因可能更复杂，某些致癌剂更易于攻击CpG岛所在位置[13]，因此致癌剂对CpG岛的攻击作用和5-甲基胞嘧啶自动脱氨基作用在肿瘤突变形成过程中的重要性，还有待研究证实。另外，p53可以由于肿瘤抑制基因p14ARF甲基化沉默而失活，p14ARF通常抑制MDM2，一种诱导p53降解的原癌蛋白[14,15]。

2.1.3 细胞周期抑制基因p16INK4a 在许多肿瘤中常可见细胞周期抑制基因的高甲基化，它可以使肿瘤避免老化和增殖启动[16]。p16基因定位于9号染色体长臂，在原发性肺癌中常常出现杂合性缺失，编码一个连续性表达的周期蛋白依赖性激酶抑制因子，在D－Rb通路中起着控制细胞周期的关键性作用[17]。Herman 等报道原发性乳腺癌和结肠癌中p16基因分别有31％和40％的甲基化。这暗示不同类型肿瘤中p16基因的沉默常常同甲基化畸变有关[18]。最近有人检测了子宫颈癌中p16，DAPK和MGMT基因的甲基化状态[19]，结果发现血清中和组织中p16基因的甲基化状态具有同一性，血清p16基因甲基化状态可以作为评估肿瘤治疗的潜在指标。另外在食管鳞状癌细胞株研究中发现[20]，启动子甲基化导致了p16INK4a失活，而外显子的纯合性缺失和框码移位缺失导致了转录沉默或突变蛋白的产生。

2.1.4 E-cadherin 侵袭抑制基因和乳腺癌在对乳腺癌细胞株中E-cadherin的CpG岛研究发现，E-cadherin在高甲基化时基因无表达[21], 而在原发性乳腺癌E-cadherin甲基化率高达45％。在对一系列乳腺癌细胞株研究后发现，序列缺失和甲基化是导致E-cadherin表达缺失的主要原因[22]。

2.1.5 DNA修复基因在基因的修复通路中，DNA甲基化起着重要作用。目前研究发现DNA甲基化与基因修复的关系主要表现在以下几个方面：由于DNA错配修复基因hMLH1的沉默导致散发性结直肠癌[23]，胃癌的微卫星不稳定[24]；MGMT启动子的高甲基化阻止鸟嘌呤O6位置的甲基基团转移，引起p53和k-Ras基因突变[25,26]；有丝分裂终止点基因CHFR高甲基化[27]；乳腺癌和卵巢癌BRCA1的失活[28]，阻止DNA双链断裂点修复并引起整体基因表达的改变。

2.2 肿瘤中整体的低甲基化

多种肿瘤的研究结果表明，肿瘤组织相对于正常组织整体呈现低甲基化状态[29]，这种特征可以通过检测基因组中DNA甲基化胞嘧啶的丰度[30]或者寻找带有甲基化敏感性酶的重复序列[31]来观察。目前有3种机制解释基因组整体的低甲基化在肿瘤中所扮演的作用。第一，低甲基化导致原癌基因的去甲基化失活如MYC原癌基因失活[32]；第二，整体的低甲基化是细胞染色体不稳定的易感因素[33]；第三，低甲基化使肿瘤转移增加[34]。但有人[35]认为在肿瘤发生发展过程中，除了DNA甲基化导致染色体不稳定外，转座子成分活化和基因的印迹缺失也是一个重要因素，DNA低甲基化有助于有丝分裂重组，导致杂合性丢失和典型的可检测核重排增加，而且在人类肿瘤中常可见染色体处着丝粒广泛的低甲基化，这可能在肿瘤细胞的染色体非整倍体中起作用。

3 肿瘤中DNA甲基化的应用

针对DNA甲基化在肿瘤中的作用，一方面，对于人们早已熟悉的肿瘤抑制基因如BRCA1，hMLH1等，需要对其在肿瘤中的甲基化沉默作用进行鉴别，从而使相关进展应用于临床肿瘤治疗；另一方面，建立在亚硫酸氢钠修饰和PCR技术上的研究DNA甲基化的新技术不断涌现，使有关DNA甲基化在肿瘤中所起作用的各种研究可以不断深入，从而针对DNA甲基化的应用可望渐渐展开。主要有如下几方面的应用。

3.1 肿瘤筛查和风险评估

目前临床上已经对大多数肿瘤确立了有效的诊断手段，但许多诊断手段耗费昂贵，具有破坏性，限制了这些方法在患者中的应用。多种证据表明，甲基化检测能够有效预测不同肿瘤中个体的风险率，以致在肿瘤的诊断前期可以有效应用筛查实验和预防性治疗措施。例如，在检测了结肠癌患者血样中甲基化导致的胰岛素样生长因子II的印迹缺失后发现[36]，所有样本中均为印迹缺失，相反在无肿瘤的个体仅有10％的结肠组织和血样检出印迹缺失，对这部分个体而言意义重大。

3.2 肿瘤病理分型和治疗

肿瘤病理的分型影响了临床医生对治疗方案的选择。研究表明甲基化指标的鉴定有助于肿瘤的临床病理分型。例如胶质瘤有多种病理亚型如星形细胞瘤、少突神经胶质瘤、胶质母细胞瘤等，分级复杂。Uhlmann等[37]应用7个甲基化指标的不同甲基化模式可以描述特异的胶质瘤分级和胶质瘤亚型。Shi等[38]应用甲基化敏感的寡核甘酸芯片技术，在分子水平从I/II级卵泡细胞淋巴瘤中区分出外套细胞淋巴瘤。因此，应用甲基化指标和其它分子标记有助于新的肿瘤亚型的分型。

在治疗方面，肿瘤预后的信息有助于治疗方案的选择，相对于威胁患者生存的肿瘤而言，无侵袭性和生长缓慢的肿瘤可采用温和的治疗手段。多个研究报道表明一个或者多个基因的甲基化状态与肿瘤的复发或者生存率相关。如研究发现[39]，在非小细胞肺癌中，ＭＧＭT甲基化的患者5年生存率达35％，而MGMT无甲基化的患者5年生存率可达52％。

在针对肿瘤DNA甲基化的治疗方面，学者们很早就开始在体外应用DNA甲基化抑制剂活化沉默的高甲基化基因。Azacitidine (5-azacitidine)和地西他宾 (5-aza-2-deoxycytidine)是1964年最初由Piskala等[40]和Pliml等[41]合成的抗DNA甲基化试剂，也是应用最广泛的试剂。但由于DNA甲基化抑制剂特异性不强，会引起整体的低甲基化；同时在大剂量应用时会对正常细胞有毒副作用[9,42]。尽管如此，仍有成功应用于临床的一些实例，如在急性粒细胞白血病中的应用[43]。另外，也有研究发现[44]，azacitidine 能够在肿瘤特异性的DNA位置产生去甲基化作用,在用azacitidine 处理EB病毒相关性鼻咽癌和淋巴瘤后，比较其处理前和处理后的甲基化状态，结果表明在所有含病毒启动子的目的组织中有大量去甲基化。

3.3 肿瘤治疗监测

考虑到恶性肿瘤具有治疗后易于复发的特征，因此在治疗完成以后，检查肿瘤组织是否从体内完全剔除及间断性的监测肿瘤复发显得极为必要。由于DNA甲基化对肿瘤的重要作用，因此学者们建议把甲基化作为一个潜在的筛查指标。

在应用卡氮芥治疗肿瘤患者时，针对胶质瘤的研究发现[45,46]，MGMT启动子区的高甲基化是化疗效果反应良好的指示剂，患者整体生存延长。研究表明，这种改变可能与MGMT的表观遗传学沉默和肺、脑、结肠肿瘤中p53，k-Ras等基因突变累积更多相关[47]。同时，MGMT也可以作为环磷酰胺化疗反应指示剂[48]。另外，其它的涉及DNA修复的基因和药物代谢基因的甲基化状态也可以作为化疗效果的指示剂[49～51]。

4 肿瘤中DNA甲基化的检测

在过去10多年中，DNA甲基化检测技术已经有了长足的进步，从而带动了整个表观遗传学的发展。多种方法被用来筛选整个基因组中新的甲基化标记物，大体分为用甲基化酶处理后进行检测和用化学修饰后进行检测的方法。用甲基化敏感性限制性酶修饰后建立的方法包括MS-AP-PCR(methylation-sensitive arbitrarily primed PCR)[52]，MCA(Methylated CpG Island Amplification)[53]，RLGS(Restriction Landmark Genomic Scanning)[54]和DMH（Differential Methylation Hybridization）[55]。这些方法可以检测不同组织之间甲基化状态的差异，通过这些方法，研究人员可以在肿瘤标记物发展的早期阶段得到关于肿瘤诊断的一些信息。

另一类方法是建立在化学修饰的基础上，通过对基因组DNA用亚硫酸氢盐处理，结果产生在甲基化胞嘧啶和未甲基化胞嘧啶之间的不同反应：未甲基化胞嘧啶转换为尿嘧啶，而甲基化胞嘧啶则没有变化。由于甲基化信息的不同导致序列转换的差异使研究人员能够建立起标准的检测方法，如测序[56]、芯片分析[57,58]和甲基化PCR[59,60]。对这些方法的选择取决于是否需要定量，敏感性和高通量。另外，在科研和临床应用中，为了从无甲基化的DNA背景中检测到甲基化的DNA，学者们建立了以PCR为基础的更敏感的荧光定量检测的方法如MethyLight[61]和HeavyMethyl[62]及其它实时定量的方法[63]。

总之，在肿瘤研究中，肿瘤相关基因的甲基化沉默表明DNA甲基化在肿瘤发生发展过程中起着重要的作用，但在阐明肿瘤表观遗传学与肿瘤发生发展的具体关系上，DNA甲基化抑制剂的具体机制和寻找特异性更强的DNA甲基化抑制剂，还有更多工作要做。

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