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功能基因组学实验----致病基因敲除技术简介
唐伟
利用同源重组的方法建立基因敲除技术，在将位于病源微生物染色体或者质粒上的与致病性有关的功能基因敲除后，比较基因敲除微生物与原始微生物在致病性等一系列指标（表型）上的差异。本实验以幽门螺杆菌为研究对象，针对其鞭毛丝帽蛋白（又称鞭毛钩相关蛋白2，HAP2）进行基因敲除，鞭毛丝帽蛋白由FliD基因编码，与HAP1（FlgK）和HAP3（FlgL）共同构成鞭毛钩属蛋白，参与鞭毛丝状体远端的戴帽，使鞭毛蛋白单体组装成鞭毛丝状体，在幽门螺杆菌结构性群体形成及其致病机理方面有重要作用。利用基因缺失技术构建了FliD基因缺失的幽门螺杆菌突变株，通过比较突变株和野生株的生物学性状的变化，研究FliD基因的功能。学生通过本实验学习同源重组方法进行基因敲除的技术流程，了解基因敲除技术在现代医学研究中的应用。
材料与方法
菌株和质粒 幽门螺杆菌Hp26695，大肠杆菌DH5α，质粒pUC18－K2，pILL570， pMD18－T Simple Vector。
主要试剂及工具酶 ExTaqTM酶，DNA marker DL2000及质粒抽提试剂盒为TaKaLa公司产品，E.Z.N.A Gel Extraction kit购自济南科睿生物科技公司，Lambda DNA/EcokΙ+HindⅢ Marker3,内切酶EcoRΙ，BamHΙ,ClaΙ,PstΙ,T4DNA ligase,Xgal,IPTG均为上海生工产品。
Hp 的培养及基因组的提取 Hp26695接种于含10％卵黄的Skirrow平板上置37℃微需氧环境中（5％O2，10％CO2，85％N2）培养，基因组的提取参照《精编分子生物学实验指南》一书中细菌基因组DNA制备的操作规程进行：
1)培养5mL的细菌培养物至饱和状态，离心2min。
2)沉淀物加入567PI‘的TE缓冲液，用吸管反复吹打使之重悬。加入30uL10％的SDS 和3ul 20 mg／ml的蛋白酶K，混匀，于37℃温育1h。
3)加入100 uL 5mol/l的 NaCl，充分混匀，再加入80uL CTAB／NaCl溶液，混匀，于 65℃温育10min。
4)加入等体积的氯仿／异戊醇，混匀，离心4—5min，将上清液转入一个新管中，如果难以移出上清。先用牙签除去界面物质。
5)加入等体积的酚／氯仿／异戊醇，混匀，离心5min，将上清液转入一只新管中。
6)加入o．6体积异丙醉，轻轻混合直到DNA沉淀下来，离心沉淀，加1mL的70％乙醇洗涤。
7)离心5min，弃上清，干燥，重溶于100 ul的TE缓冲液，0.7％的 琼脂糖凝聚电泳检测。
所提取基因组DNA溶于TE溶液中－20℃保存备用。
引物的合成及PCR扩增：自pubmed中搜索得到Hp鞭毛丝帽蛋白的编码基因FliD gene的序列，针对其两端的保守序列设计PCR引物，由上海生工合成：
引物1 5’ Ccatcgatgggcttggcagtaaggtttt
引物2 5’Ggaattcctagcgtccgtgatgctttgag
引物3 5’Cgggatcctacgggcttagtttagacgat
引物4 5’ aaaactgcagccataatgttgtagcgggttt
其中atcgat为ClaΙ的酶切 位点，gaattc为EcoRΙ的酶切位点，ggatcc的酶切 位点BamHΙ, ctgcag的酶切 位点PstΙ。以 Hp基因组为模板进行PCR反应，扩增反应体系的构成参照TaKaRa ExTaqTM酶ＰＣＲ试剂盒说明操作。反应混合物在94℃变性1ｍｉｎ后,经94℃30ｓ,55℃30ｓ,72℃1ｍｉｎ,循环30次,再于72℃延伸5ｍｉｎ;产物于2％琼脂糖凝胶中电泳，利用E.Z.N.A Gel Extraction kit回收后4℃保存备用。其回收步骤为：
1）利用琼脂糖凝胶分离DNA片段（使用新的TAE缓冲液作电泳，重复利用其 pH会升高影响产量）。
2）在紫外灯下切下所需的DNA片段（切下的凝胶尽量小，DNA在紫外灯下暴露时间尽量少于30s）
3）在1.5ml的Ep管中称取所切凝胶的重量，按密度1g/ml估算凝胶的体积，加3－4倍凝胶体积的 Binding buffer，置55－60℃温育7min或到凝胶完全溶解，加1倍凝胶体积的异丙醇（当DNA<500bp或>4kb时加1.5倍体积的异丙醇），凝胶溶解后观察溶液的颜色，当为红色或橙色时，加5ul5M的乙酸钠（pH5.2），混合物应变为淡黄色。
4）加750ul溶液于HiBind DNAspin－column中，同时柱子放在2ml的收集管中，8000－10000g，室温离心1min，弃掉液体，在加750ul连续离心。
5）加300ul Binding buffer洗涤柱子，10000g离心1min。
6）加750ul Washing buffer于柱中，室温静置2min，10000g离心1min。
7）弃掉液体，重复步骤6。
8）弃掉液体，10000g离心空柱子1min，干燥柱上基质。
9）把柱子放入1.5mlEp管，加30－50ul稀释buffer或灭菌双蒸水于柱中，50℃水浴2min，10000g离心1min。
PCR产物的重组及克隆 回收的PCR产物按照pMD18－T Simple Vector试剂盒说明，22℃进行连接3h，连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α在含Xgal,IPTG及氨苄青霉素的LB琼脂培养基中筛选培养。挑取单个白色菌落置于含Amp的培养基中培养，利用质粒抽提试剂盒进行提取并利用PCR方法进行鉴定。
目的基因的制备 含FliD基因两端区域基因片段的重组T载体，含卡那霉素抗性基因的pUC18－K2质粒以及载体pILL570分别经相应的双酶切，低熔点琼脂糖电泳及凝胶回收试剂盒回收目的基因片段，置4℃保存备用。
突变载体的构建 将回收的目的片段于1.5％的琼脂糖凝胶中电泳分析，kam/EcoRΙ+BamHΙ，fragment1/ ClaΙ+ EcoRΙ,fragment2 BamHΙ+PstΙ，pILL570/ ClaΙ+PstΙ按2：2：2：1的摩尔比在22℃连接3h，取10ul连接产物转化感受态的大肠杆菌DH5α，然后将转化菌涂布于含卡那霉素及大关霉素的LB平板上培养12h，挑取单个菌落置含以上两种抗生素的LB培养液中37℃振摇过夜培养，提取质粒进行双酶切和PCR进行鉴定。
突变株的构建 自培养48h的固体培养基上收取Hp（106CFU/ml），用15％甘油－9％蔗糖溶液洗涤，4℃离心，沉淀重悬于50ul甘油蔗糖溶液，冰上放置1min，加重组质粒DNA5ug混匀，移入－20℃预冷的电击池（0.2cm），冰浴5min，电击池置于电穿孔架上，电击条件：25uF，2.5kV，200Ω，5ms，电击后将Hp涂布于无抗生素的Skirrow平板上，37℃微需氧环境中培养48h，然后转移到含卡那霉素（25ug/ml）的Skirrow平板上培养72h，收取细菌。
突变株的鉴定 收取的细菌经革兰氏染色和尿素酶实验证实为Hp，制备突变株及野生株的基因组DNA，针对其UreB和FliD基因，采用PCR方法扩增，扩增产物于1％的琼脂糖凝胶中电泳分析。
结果
目的基因片段的制备及回收 FliD两端的PCR产物连接到pMD18－T Simple Vector后分别经ClaΙ+ EcoRΙ和BamHΙ+PstΙ双酶切，pUC18－k2经EcoRΙ+ BamHΙ双酶切，载体pILL570经ClaΙ+PstΙ双酶切得到的目的基因片段经E.Z.N.A Gel Extraction kit回收分别得到的目的基因片段的纯化产物（见图1）。
突变载体的构建及酶切鉴定 图2为突变载体的构建路线示意图，突变载体的插入片段中两侧为FliD基因两端的保守序列，中间为卡那霉素抗性基因。所构建的突变载体分别经ClaΙ+PstΙ，ClaΙ＋BamHΙ，EcoRΙ＋PstΙ双酶切产生的片段，并经PCR扩增得到的片段与预计片段大小一致。
突变菌株的构建及鉴定 电穿孔法转化得到Hp后经卡那霉素抗性基因筛选得到的突变株，经革兰氏染色和尿素酶实验证实为Hp后，针对突变株及野生株的UreB和FliD基因，采用PCR方法扩增，结果显示：尿素酶UreB基因的1278bp片段在突变株及野生株中均可检测到，而FliD基因的2025bp片段仅出现在野生株中。
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