文/王丽红，刘均洪  青岛科技大学化工学院药物工程实验室

酶能催化各种各样的反应，从而推动了生命的进程，因此可用来作为有价值的治疗药物。高通量筛选方法已成为药物研发中的重要技术，能从大量的化合物文库中筛选出侯选药物，几种灵敏可靠的分析技术也已特定地应用于生物催化活性的高通量检测。高通量生物催化检测平台加速了酶靶标的筛选，且对药物发现过程的各个阶段都有潜在的影响，包括前导物识别和优化以及吸收、分布、代谢、排泄和毒性评估。这些进步必将使高通量生物催化检测成为制药业中一种必不可少的工具。

过去的30年中，生物科学所发生的显著进步使制药公司在研发那些复杂的功能极强的药物上的开支大大增加。这些功能极强的药物的发现，使得对那些对靶物质具有活性的化合物的识以及临床应用上对这些化合物进行评价和优化成为必需。药物的整个研发过程是非常复杂的，效率低，耗时长，成本高。2002~2004年间药物的研发成功率仅有0.1%，开发一种新药的成本大约8亿美元，平均需要 8.5年的时间。为了提高成功率研究人员就致力于从海量的生物学领域里寻找合适的靶物质，从化学空间寻找新的侯选药物。加速药物研发的“快速工具”包括组合化学、生物催化和高通量筛选。

酶能催化各种各样的生物转化过程，如激酶在信号转导中有着重要作用；细胞色素催化异生物体的代谢；蛋白酶在脱噬作用中起关键作用。因此酶是处理大量疾病的首选靶物质，如癌症、HIV、炎症和心血管病症。基因组学的发展使这些靶物质的数量呈级数增长；组合化学的发展为合成那些具有潜在治疗作用的分子文库提供了新的展望。它们的协同发展加速了药物的发现，并对酶的抑制作用提供了快速可靠的检测。

高通量筛选（HTS）已成为药物发现和相关研究的一柄利器。在过去的10年中，HTS技术已得到几种前沿技术的支持，如液体处理和多孔板分布的自动化技术，高灵敏度的检测系统（微阵列技术），数据采集传输处理系统。这些进步也促使药物发现不同阶段的变更，从靶物质识别到毒性鉴定。新的范例也使对大量化合物文库的初步评价的采样数增加，这些化合物可以影响靶物质酶的生物催化活性。本文主要介绍了分析技术的近期发展情况以及用于前导物识别和毒性筛选的高通量生物催化检测的新的技术平台。

生物催化活性的检测技术

在药物发现过程中，前导物识别的一个重要方面是生物活性筛选检测，通过该过程那些能够最有效地刺激或阻碍靶物质酶的化合物就被筛选出来。该筛选检测过程在体内环境下也应是具有代表性的，这样就可对结果进行可靠的解释。一个好的筛选检测技术应具有以下要求：高的目标特异性和灵敏度、重现性和稳定性。此外，在高通量格式上所选择的筛选检测方法要求具备易于自动化、低工作容积、易于微型化的特点。

检测技术是以视觉读出为基础的，如荧光测定，它是将一种非荧光物质经生物催化转化成一种荧光产物，该方法因相对简单，易于自动化，不需要纯化步骤而被广泛使用。新发展的荧光免疫检测具有更高的特异性，但需要有一种抗体可以选择地结合在生物催化产物上。在制药业上，一般的放射性检测主要用来筛选激酶抑制剂，因为激酶的大量底物和ATP可以进行放射性标记，并能通过磷酸化作用进行跟踪而不依赖于特定类型的激酶或底物。

然而，在应用上就要求对产物的结构特征进行表征，或者是对那些毫无目标特异性的复杂混合物进行检测。更先进的分析技术，如液相层析/质谱（LC/MS）和核磁共振(NMR)，已取代了上述的功能分析。例如，LC/MS在高通量吸收、分布、代谢、排泄（ADME）检测中对于代谢产物的鉴定是一种非常有效的工具，因为它兼有LC的选择性和 MS的灵敏性，并且易于自动化。NMR分光检定法传统上用于药物作用的机制研究，现在也用于酶抑制剂的高通量筛选。

前导物识别的生物催化检测

丰富的现代化学药品文库，主要是那些较大的制药公司生产的上百万的化合物，使得可用于前导物发现和优化的高通量生物分子筛选成为必需。最近几年，HTS通过多孔或微阵列格式已有效地应用于发现靶物质酶的小分子抑制剂。下面我们讨论了几种不同的可用于生物催化检测的高通量筛选的技术平台。

物理法固定化酶和底物
酶的物理包埋已成功的应用于大量的生物化学和生物药学领域，后来也用于高通量生物催化检测。将酶固定化于多孔疏松的基质上（如溶胶）可以减少样品的使用量，并能优化液体处理，保留酶的内在催化活性。此外，将酶用溶胶包埋于多孔板上可以提供一个经济的可重复的酶抑制作用检测法。溶胶基质在高通量微阵列格式中也用来共固定化激酶和它的肽底物，从而来评价激酶抑制剂的抑制作用。

将酶包埋在琼脂糖凝胶中对于从上千种化合物中筛选对蛋白酶和激酶有抑制作用的化合物是非常有效的。在一个无孔高密度的技术平台中，也称作微阵列化合物筛选（uARCS），酶被固定在琼脂糖凝胶中，而荧光底物则被固定在吸墨纸上。将一个大的化合物文库印在一个聚苯乙烯层上，然后与酶凝胶和底物层相接触，化合物对酶促反应的抑制作用通过荧光读出进行检测的，该格式与384孔板检测法相比在经济上可节省10倍。在另一种低容量高通量凝胶检测法中，将硅胶板在各种不同的荧光酯类底物中浸湿以作为样板，从而来获得不同酶家族的“指纹”，包括脂肪酶、酯酶和蛋白酶。总之，微阵列技术为从大量的底物（或抑制剂）文库中获得二维资料或酶活性（或抑制作用）的“指纹”提供了机会，并且对大量数据集组的视觉分析也是非常便利的。

共价固定化酶和底物
共价固定生物分子来进行酶的检测不需要进行包埋并且避免了外部固定化基质所带来的一些潜在问题，如酶的滤去，基质特性随时间的变化，传递限制等。因此，就要研究如何把酶、肽或小分子底物共价联结到一个功能化的玻璃表面上。由于在蛋白质微阵列中蛋白质是共价联结在载玻片表面上的，因此研究人员就利用蛋白质微阵列来确定蛋白质之间，蛋白质与小分子物质之间，蛋白质与DNA之间的分子识别作用。首先将酶共价联结到功能化的载玻片上，然后通过荧光标记的亲和标签探针来评定酶在空间定位斑上的活性，该探针与酶以一种活性相关的方式结合。另外，蛋白质微阵列在评价酶的动力学和表征抑制机制方面也是非常有用的。
由肽序列组成的肽微阵列在“指纹法”某一特定酶的底物特异性上是一个理想的平台。肽微阵列的一个重要应用就是识别激酶的底物，例如，由2,900和13,000个肽组成的文库可分别用来显示CK2和Ab1激酶的底物特异性。肽微阵列是通过将氨基-氧-乙酰化的13-mer肽序列共价结合到乙醛功能化的载玻片上而制成的。荧光标记的抗磷酸酪氨酸抗体可以用来检测激酶的生物催化活性。

肽微阵列也可用于“指纹法”蛋白酶的底物特异性，并已成功地应用于丝氨酸蛋白酶凝血酶。通过一个酰胺交联剂和香豆素分子将大量四肽序列共价联结到一个乙醛衍生化的载玻片上就可制备一个含有361个荧光肽的阵列。肽基香豆素底物是没有荧光的，但是通过溶蛋白性裂解后香豆素的荧光就可恢复。同样，含有一个酶识别结构域的荧光底物的小分子衍生物也可以固定于一个功能化表面上，连接状态的底物是没有荧光的，但通过酶的识别与催化后空间定位的荧光可被恢复。荧光基团可以结合到大量的酶识别序列上，共轭分子也可以通过多种方式固定在载玻片表面上，因此就可以产生各种各样的适合表征大量不同酶的微阵列。

液相微阵列

小分子微阵列的发展常常要求对底物或抑制剂进行共价修饰，但通常情况下这些工作是不值得做的。于是就发展起了一种不需要对配基进行化学修饰，而能从一个液相组合文库（纳升规模）中直接筛选出所需化合物的技术。最近，Angenendt等人研制了一种微阵列，可对组织蛋白酶D进行液相抑制检测，通过多次点样步骤对荧光底物、酶和抑制剂进行打印。

一个重要的发展趋向于研究发生在载玻片上的单相反应。Gosalia和Diamond在一个微阵列上使用悬浮颗粒沉积技术评估了一个小分子文库对胱门蛋白酶的抑制能力。该技术是将一个含有352个成员的组合文库置于甘油中，然后以每滴1.6nl点样于显微镜载玻片上，而包含酶和荧光底物的生物样品则连续地置于抑制剂微阵列的表面。该方法可以用来检测丝氨酸蛋白酶对含有722个成员的合成文库中的荧光底物的特异性，文库分子的一般格式是：Ac-Ala-P3-P2-(Arg/Lys)-香豆素（P3、P2为氨基酸）。

液相微阵列也用于检测15万多种化合物对因子Xa的抑制作用以及获得一些临床上重要的蛋白酶的有效抑制剂的IC50资料。该方法的最大优点在于底物和载玻片都不需要进行衍生化作用，因此液相微阵列芯片可以阵列各种现有的化合物文库。然而，甘油的高浓度对酶的活性可以造成不利的影响，因为通常情况下酶的最佳活性是在水环境下表现的。

药物代谢和毒性的生物催化检测

对一个侯选药物来说一个最大的障碍就是该化合物可与肝中酶发生作用，主要是细胞色素P450s (CYPs)。其中一些化合物可以抑制CYPs的作用，一些经代谢后可生成有毒的产物，从而引起副作用和潜在的致命反应。从运行的可行性讲，在药物开发过程的早期识别这些毒性侯选物是非常有利的。荧光检测为高通量检测CYP的抑制作用和代谢机制提供了一个相对简单的方法。然而，该方法也存在一些缺点，如缺乏探针特异性、荧光熄灭、被测化合物及其代谢产物对荧光的干扰。因此，对CYP抑制作用的荧光检测通常只作为高通量的初步评价，以后还要采用LC/MS对高通量检测进行进一步的评估。

LC/MS具有高的灵敏度能够在药物开发过程中确定各种化合物的结构，但是它的处理量因分离和定量代谢产物相当费时而受到限制。为了提高LC/MS检测的处理量，研究人员就对自动样品制备和液体处理方法进行了改进。方法之一就是将各种底物样品混合在一起，这样就可以减少待分析的样品的数目[15]；此外，一个重要的改进是层析柱的使用，它允许更快的流速和梯度洗脱，因而可以缩短各种样品的流通时间；再进一步改进就是引入并行LC/MS方法，该方法是将流体平均地分成多束流进并联的多个柱中，重组后再进行MS分析。最近也有文献报道了HT-LC/MS技术在药物发现中的应用。

大多数有关CYP抑制作用和毒性的研究都是在液相多孔板上进行的，也有人采用固定化CYPs于溶胶中来进行高通量ADME检测。Sakai-Kato等人研发了一种溶胶包埋CYP阵列来对CYP介导的代谢机制进行高通量分析。溶胶固定化CYPs技术也是用于毒理学检测的一个微量平台的基础。药物代谢物是通过将前药溶液点样于一个生物催化微阵列上的30nl固定化斑上而产生的，该微阵列也称作 MetaChip(代谢酶毒理学检测芯片)。代谢物的毒性是通过将含有药的MetaChip与一细胞单层相接触，然后定量每个斑上的细胞死亡数来进行评估的。MetaChip提供了一个原位结合代谢物合成和细胞毒性筛选的方法，因而可以在药物发现过程的早期对化合物进行快速经济的评价。
高通量技术在药物发现中的作用是非常明显的，这从过去几年的HTS实验室中侯选药物数量的不断增加就可以看出。HTS的特点是微型化和自动化，这就减少了试剂的使用量和分析时间，减少了一些高劳动强度步骤，尤其是降低了检测成本。本文所介绍的生物催化检测法主要用在药物发现过程的早期阶段，如抑制剂识别和获取前导化合物抑制作用资料。在药物发现过程的后期，失败的主要原因是与CYP抑制作用相关的毒性或CYP产生的代谢物的有害作用。高通量生物催化检测由于使用了药物代谢酶因此可以预测这些毒性。除此之外，一个还待开发的新生领域是将高通量技术用于组合生物催化。酶具有高的对映选择性和区域选择性，因此可以产生手性合成子和药物中间体，而这些物质通过化学方法是很难合成的。类似于本文所介绍的生物检测法，也可以用酶催化一个特定的前导化合物来产生多种衍生物和活性代谢产物，这些分子可以通过HT-LC/MS和NMR技术被快速表征。