为什么去除DNA？

全球市场对单克隆免疫球蛋白（IgG）和重组蛋白质的需求增长迅速。细胞培养技术的发展显著提高了单克隆生产效率，杂交瘤细胞上清液中的单克隆抗体浓度每升约为1克。

但是，在细胞生长和细胞收集期间，一定数量的核酸可能会污染相关产品。核酸污染可能源自宿主细胞DNA：或者是基因组、病毒载体或者是反转录酶核糖核酸，这些物质更具危险性。尺寸大于2个千碱基的片断就被认为有可能致癌，因此核酸必须从成品中去除。

美国的生物评估与研究中心（1）最初确定可允许的最大核酸污染为每剂量10pg。世界卫生组织（2）已宣布，每剂量100pg也合格。近来，生物评估与研究中心（3）的最新观点是“应该对细胞系生产的生物制品中的DNA含量进行分批试验，应确立反映纯度水平、可以合理且一致性实现的分批释放限值。”这一切都意味着，需要采取一种迅速且成本效益高的方法，将核酸清除至允许含量（理想检测值）以下。

为什么使用膜色谱法清除DNA？

清除核酸有几种方法。这些方法中，我们特别提出阴离子交换色谱法，它被证明是极有效的方法，因为核酸的负电荷高，离子强度高，pH＞2。在这种条件下，大多数生物制剂疗法蛋白质不能与阴离子交换矩阵发生反应。因此，阴离子交换（4、5）作为第一步骤通常被认为是适当的，因为它同时有助于降低蛋白质样品的粘度。另外的方法包括，利用流穿模式的阳离子交换与核酸酶（6、7）清除有污染性的核酸。

尽管传统的阴离子交换树脂色谱法可用于去除核酸杂质，但 DNA是一种非常大的生物分子（与直径通常为1－10纳米的球状蛋白质相比，它的直径可达到500纳米），它很难扩散进入树脂粒的小孔中（20－100纳米）。相反，Mustang Q阴离子交换膜的孔就大得多（800纳米），表面面积更大，因此扩散限制更少。

同时，与传统树脂介质相比，Mustang Q膜的蛋白结合能力至少是其10倍。（25毫克DNA/毫升介质），而且流速更快（超过10CV /分钟）。

这些装置因此设计为囊式和筒式滤器。如果一次性使用，则无需清洁或清洁验证，这很有帮助，因为当清洗传统树脂介质时，很难或根本不可能证明核酸已彻底清除。

什么是Mustang Q介质 ?

Mustang Q膜通过以下方法制作，将高度稳定的亲水性四元胺聚合体涂覆并紧密交联在聚醚砜膜表面上。最终获得一种开放式结核状结构的膜，这种膜的优点在于表面面积大，粘合负电荷大分子的能力强，且具有良好的力学性能，800纳米的孔径可极大地提高流速。Mustang Q装置由16层这种膜组成，它们被折叠并组装成即取即用的囊式滤器形式。 Mustang硬币型装置是Mustang囊式滤器按比例缩小的形式，适合用于小型试验，尤其用于验证研究时。

硬币型装置使用与Mustang Q囊式滤器和筒式滤器中相同的16层Mustang Q膜。

利用Mustang Q介质从多克隆免疫球蛋白G（IgG）制品中去除的小牛胸腺DNA

实验目标是确定下述上样条件（缓冲液成分、pH与离子强度），在这种上样条件下，DNA结合在Mustang Q 膜上，而免疫球蛋白G（IgG）制品则不结合。每种单克隆抗体都有不同的等电点，等电点将决定在任何指定的pH值条件下结合于Mustang Q 膜的能力。因此，很难仅根据一个实例确定适合所有单克隆抗体结合Mustang Q膜的方法。鉴于此原因，我们选择牛血清免疫球蛋白G（IgG）制品，它含有许多不同的免疫球蛋白G（IgG），pl范围十分广泛，因此可测出许多可能的结果。

凭借其相对较大的尺寸和超过pH2的高聚阴离子特性，与更小、更中性电荷的抗体相比较，DNA具有极高的与阴离子交换膜的亲合力。因此可以预测，酸性值小、离子强度弱时，DNA更容易与阴离子交换Mustang Q膜粘合，而免疫球蛋白G（IgG）片断几乎或根本就不与阴离子交换Mustang Q膜发生反应。为使分离更具挑战性，并更适用于工业应用，实验使用磷酸盐缓冲液进行（作为最糟糕的情形考虑），这种缓冲液由于磷酸盐阴离子的高离子强度及多重负电荷通常会干扰阴离子交换色谱。

方法与结果

我们分别进行了3项实验，首先只使用DNA，然后是多克隆免疫球蛋白（IgG），最后为两者结合使用。

第一项实验中（图2a），将小牛胸腺DNA溶液在25mM磷酸纳缓冲液pH6.0+150mM NaCI中的浓度制成25微克/毫升。将一共360毫升（7毫克）这种溶液以20CV/分钟的速度加载于Mustang Q硬币型膜装置上，这种膜以25mM磷酸纳缓冲液pH6.0+150mM NaC进行平衡，同时监控在260nm时的吸收率。用40份膜体积的平衡缓冲液冲洗之后，粘合的DNA在40CV平衡缓冲液中以150－1000mM NaCI梯度洗提。通过260nm的吸收峰情况可以判断出，当上样量315毫升时，DNA发生穿透。

第一项实险确定小牛胸腺DNA在上述条件下洗脱，盐度超过500mM。

第二项实验中（图2b），将牛血清免疫球蛋白（IgG）溶液在平衡缓冲液的浓度制成2毫克/毫升。将总计380毫升（760毫克）这种溶液利用实验1中所述的相同方法加载于Mustang Q硬币型膜装置上，并持续监控在280nm时的吸收峰。按照实验1的方法进行冲洗和洗提。

第二项实验表明，在选定条件下，牛血清免疫球蛋白G（IgG）并不粘合在Mustang Q介质上。

实验1与2确定当DNA粘合（杂质）在Mustang Q介质时，不会粘合球蛋白（所述产品）的最佳条件。

在最后一项实验中（图2c），380毫升牛血清免疫球蛋白（IgG）溶液（在磷酸盐缓冲液中4毫克/毫升）被小牛胸腺DNA（20微克/毫升）混合，随后利用实验1中所述条件加载到Mustang Q硬币型膜装置上。持续监控在260与280nm时的吸收率。通过260nm的吸收峰情况可以判断出，当上样量达到322毫升时，DNA发生穿透，按照实验1的方法进行冲洗和洗提，利用USD2279应用注释中我们自己的DNA杂交试验方法采集14毫升片断，并分析DNA含量。（图3）

在这些实验选定的条件下，小牛胸腺DNA牢固地吸附于在Mustang Q膜上。杂交试验表明，在片断24之前未检测出DNA（化验敏感值为2.5pg/毫升）。它证明了以下事实，即在达到饱和之前（实验1与实验3，粘合能力分别为18.5与18.3毫克/毫升Mustang Q膜），P32DNA杂交（图3）未检测到有DNA穿透。同时，免疫球蛋白（IgG）（小于总量的0.5%）粘合极少（根据在280nm时的吸收峰判定），这表明所述产品复原能力非常好。

讨论

实验表明，在存在牛血清免疫球蛋白（IgG）时，通过Mustang Q膜可有效去除小牛胸腺DNA。这证明了以下事实，即根据美国食品与药物管理局（FDA）的现行规定，可利用Mustang Q膜有效去除多克隆与大多数单克隆抗体制品中的核酸，将其含量控制在可检测和合格范围之内。